Diagnóstico de brucelosis bovina en leche por el Ring Test y ELISA en lecherías de la provincia de Ñuble (VIII Región) (página 2)

MATERIAL Y METODOS

El estudio fue realizado con 60 muestras
correspondientes a 60 predios lecheros de la provincia de
Ñuble (VIII Región de Chile). Las muestras fueron
recolectadas durante los meses de noviembre y diciembre de 1995,
meses que corresponden a la mayor recepción de leche por
parte de las plantas lecheras,
representado por el mayor número de animales que se
encuentran en producción (ODEPA, 1995). Los predios
fueron clasificados, según el número de animales en
lactancia al
momento de la toma de muestra, en tres
grupos:
estrato A (menos de 50 vacas) con 17 predios, estrato B (entre 50
y 100 vacas) 27 predios y estrato C (entre 100 y 150 vacas) con
16 predios. Se recolectaron 50 ml de leche en frascos de plástico
estériles, previa agitación en el estanque de
frío durante 10 minutos, y mantenidos en refrigeración a 4° C por 24
horas.

Para la prueba del Ring Test, el antígeno utilizado se obtuvo desde el
Instituto de Microbiología de la Universidad
Austral de Chile. Para la realización de la prueba fueron
extraídos del frío, tanto las muestras como el
antígeno, hasta alcanzar la temperatura
ambiental. Se depositó 1 ml de leche en un tubo Khan y se
agregaron 33 µl de antígeno mezclado por inversión varias veces e incubado a 37°
Celsius durante 1 h. Las muestras fueron leídas,
clasificándose como positivas, positivas débiles y
negativas como lo descrito en MacMillan (1990). Para la prueba de
ELISA se realizó como lo descrito por el fabricante del
kit Chekit® Brucellotest de Hoescht que utiliza
microplacas previamente sensibilizadas con el antígeno
inactivado, monofásico de B. abortus. Se
depositaron 200 µl de las muestras de leche en cada uno de
los pocillos de la microplaca por duplicado. Como controles
positivos y negativos se utilizaron los proporcionados por el
kit, 200 µl y diluidos 1:2 y fueron incubados por 90
minutos a temperatura ambiente en
cámara húmeda. Luego de la fase de lavado, se
depositaron 200 µl de conjugado monoclonal Anti-IgG
peroxidasa bovino diluido 1:200 en cada uno de los pocillos e
incubado por 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente del
segundo lavado, se agregaron 200 µl del cromógeno
proporcionado por el kit. Los resultados fueron leídos en
un espectrofotómetro a 405 nm (Dynatech®).
Las Densidades Opticas (DO) de las muestras problemas en
duplicado fueron promediadas y corregidas por sustracción
de la DO del control negativo,
estas fueron divididas por las DO de los controles positivos por
100. Se consideraron muestras positivas sobre 100%, positivas
débiles o dudosas, entre 70% y 100% y negativas, bajo
70%.

RESULTADOS Y DISCUSION

Del total de predios en estudio, 28.33% corresponden al
estrato A (menos de 50 vacas en lactancia), 45% al estrato B
(entre 50 y 100 vacas) y 26.67% al estrato C (entre 100 y 150
vacas). Existe un número de animales que no fue muestreado
en cada predio, ya que no se encontraban en período de
lactancia al momento del estudio. Este sería un
inconveniente que presentarían estas pruebas
diagnósticas de "screening", ya que excluyen animales en
estado
avanzado de gestación (período seco), vaquillas
preñadas, terneras y machos (Nicoletti, 1994). Por ello,
se recomienda su uso a intervalos de tiempo
permitiendo, por una parte, un diagnóstico seguro, y por
otro lado, un mejor control del curso de la infección en
el ganado. Los predios en este estudio se encontraban en programas de
erradicación de brucelosis bovina, utilizando la
vacunación de terneras con Cepa 19 entre los 3 y 8 meses
de edad. La vacunación de ganado adulto con Cepa 19 en
dosis reducida no fue realizada en ninguno de los rebaños
en estudio, descartando así la posibilidad de encontrar
anticuerpos de origen vacinal en la leche, los cuales
podrían ser los responsables de algunas de las reacciones
positivas, ya que estos anticuerpos originados en respuesta a
esta modalidad de vacunación permanecen altos al menos
durante un año, interfiriendo en el diagnóstico ya
sea en suero sanguíneo o leche (Nicoletti,
1990).

Tabla 1.
Diagnóstico de brucelosis bovina por Ring Test y ELISA en
leche según número de vacas en lactancia.
Bovine brucellosis diagnosis in milk by Ring Test and ELISA
according to number of milk production cows.

Los resultados obtenidos por el RT y ELISA en los
distintos estratos lecheros son presentados en la tabla 1. Se
observa que el mayor número de reacciones positivas se
encuentra en aquellos predios que poseen entre 50 y 100 vacas en
lactancia (estrato B); esto puede ser atribuido al mayor
número de muestras que corresponden a este estrato y que
fueron utilizadas en el estudio (45%). Se midieron los resultados
obtenidos por ambas técnicas
de diagnóstico mediante la comparación de
proporciones. La concordancia entre las técnicas ELISA y
RT, en la detección de la infección por Brucella
abortus (tabla 2), se puede apreciar un completo acuerdo en
las 60 muestras, correspondiendo a 18 muestras positivas y 42
muestras negativas para ambos métodos.
La diferencia entre ambos métodos se estableció en
los diagnósticos de muestras positivas débiles por
el RT (n=5, 8.3%), siendo confirmadas positivas por el método de
ELISA, apareciendo este último como un excelente
método para detectar anticuerpos contra Brucella
abortus en leche bovina. Boraker y col. (1981) obtuvieron
leches negativas al RT y positivas al ELISA (contrastando con los
resultados obtenidos en este estudio), atribuyendo una mayor
especificidad a este último. Por otro lado, todas las
muestras clasificadas como positivas por el RT lo fueron
también al ELISA. Kerkhofs y col. (1989, 1990), en un
estudio sobre un total de 1.200 predios lecheros en Francia,
obtuvieron una sensibilidad de un 22% mayor para el ELISA en
relación a los resultados entregados por el RT,
atribuyendo una mayor capacidad diagnóstica al primero.
Por otro lado, Díaz y Blasco (1994) mencionan como
factores determinantes en un Ring Test positivo, al nivel de
excreción de anticuerpos en la leche y a la cantidad de
grasa de ésta, entre otros factores. El ELISA no depende
de factores propios de la leche, sino que directamente con el
nivel de anticuerpos que ella presente. Esto le otorga mayor
capacidad propia para desarrollar sus diagnósticos.
Además la lectura de
los resultados no es realizada a simple vista por un operario,
sino por un lector automático, lo que podría
influir en la interpretación final de la
reacción.

Para obtener una visión acerca del nivel de
infección por Brucella abortus en los predios
lecheros de la provincia de Ñuble que enfrían su
leche, es que se determinó la prevalencia predial de la
enfermedad usando los resultados de ambas técnicas
diagnósticas (tabla 2). El resultado fue de 30% para ambos
métodos. Cabe señalar que el resultado obtenido
aquí estaría por sobre la realidad regional
manejada por el S.A.G. que alcanzaría a un 22% de
prevalencia predial (Vera, 1996). Esto indicaría que la
enfermedad se encuentra presente aún en muchos
rebaños, ocasionando pérdidas a los productores,
siendo necesaria la implementación de nuevas medidas
destinadas al control de esta importante enfermedad
zoonótica. Adicionalmente, las prevalencias para cada
estrato lechero usando los resultados del RT y del ELISA (tabla
3) resultaron en un 29.4%, 25.9% y un 37.5% para los estratos A,
B y C, respectivamente.

Los porcentajes de positividad por estrato muestran al
estrato C (entre 100 y 150 vacas en lactancia) como aquel que
alcanza el mayor porcentaje de predios positivos para ambos
métodos. En estos predios, el manejo preventivo para el
control de la brucelosis bovina se complica, ya que se requiere
de infraestructura necesaria como maternidades que permitan el
cambio de cama
o bien la desinfección del piso, pudiendo eliminar alguna
posible contaminación con Brucella abortus
luego del parto
(Nicoletti, 1994).

Tabla 2.
Concordancia entre
los métodos ELISA y Ring Test en el diagnóstico de
la brucelosis bovina en leche.
Concordance between ELISA and Ring Test methods in bovine
brucellosis diagnosis in milk.

Tabla 3.

Prevalencia de brucelosis bovina según número
de vacas en lactancia
determinado por Ring Test y ELISA en leche.
Prevalence of bovine brucellosis according to number of milk
producing cows determined by
ELISA and Ring Test in milk.

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1Laboratorio de Microbiología,
Departamento de Patología Animal, Facultad de Medicina
Veterinaria,
Universidad de Concepción, Campus Chillán, Casilla
537, Chillán, Chile.