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Evaluación diagnóstica de fracciones cromatográficas de Fasciola hepatica mediante Western Blot y ELISA en animales infectados


Partes: 1, 2

    Publicación original: Arch. med. vet., 1997, vol.
    29, no.2, p.283-294. ISSN 0301-732X.
    Reproducción autorizada por: Revista Archivos de Medicina Veterinaria ffredes[arroba]abello.dic.uchile.cl

    RESUMEN: La fasciolosis causada por Fasciola
    hepatica
    se diagnostica rutinariamente mediante el examen coprológico.
    Debido a que este examen no es 100% sensible y además es ineficaz en la etapa
    pre-patente, se realizó este trabajo con el objeto de caracterizar y
    seleccionar fracciones antigénicas de valor diagnóstico de extractos de
    excreción-secreción del parásito.

    Se utilizó cromatografía de
    exclusión por tamaño molecular (Sephacryl S-300), electroforesis en geles de
    poliacrilamida en ambiente reductor (SDS-PAGE) y posterior western blot (WB),
    además de un método de "enzyme-linked immuno-sor-bent assay" (ELISA)
    en microplaca. Para evaluar el valor diagnóstico de los antígenos se usaron
    sueros de las especies ovina, porcina y equina en tres estados (sanos, con
    otras parasitosis y naturalmente infectados con F. hepatica).

    Mediante el método
    cromatográfico se obtuvieron hasta 5 "peaks", que interpolados en una
    curva patrón representaron polipéptidos de pesos aproximados de 2.000, 400,
    150, 29 y menores a 29 kDa. De éstos, los inmunorreactivos específicos para la
    enfermedad en las tres especies animales, bajo los criterios de SDS-PAGE y
    posterior WB, fueron los de 400, 150, 29 y <29.

    La evaluación mediante
    ELISA en microplaca, de estas fracciones con los sueros de las tres especies
    animales infectadas, indicó que la fracción de 29 kDa ofreció valores de
    sensibilidad y especificidad de 94.5% y 93.5%, respectivamente. Similares
    valores de sensibilidad y especificidad se determinaron al enfrentar esta
    fracción antigénica con sueros de ovinos en la etapa prepatente de la
    infección. Esta misma fracción analizada por el criterio de SDS-PAGE y luego
    por WB dio dos bandas de reconocimiento específico, una de 29 kDa y otra de 14
    kDa aproximados. Con estos resultados concluimos que la fracción cromatográfica
    de 29 kDa sería capaz de discriminar en las especies ovina, porcina y equina,
    entre aquellos animales sanos, con otras parasitosis y con fasciolosis. Además
    fue también eficiente para diagnosticar la infección en etapa prepatente en
    ovinos. Por ello se constituye en una fracción promisoria para ser purificada y
    empleada en estudios epidemiológicos mediante ELISA.

    Palabras claves: fasciolosis, diagnóstico,
    SDS-PAGE, Western Blot, ELISA.

    SUMMARY: Diagnostic evaluation of
    chromatographic fractions of Fasciola hepatica
    by Western Blot and ELISA
    in infected animals

    The antigenic components of
    excretory-secretory products of adult F. hepatica, were separated by gel
    filtration chromatography (Sephacryl S-300) and then analized by polyacrylamide
    gel electrophoresis (SDS-PAGE), followed by Western Blot (WB). In order to
    evaluate the sensitivity, specificity and predictive value of the selected
    fractions an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used with sera from
    sheep, swine and horses infected with F. hepatica, as well as with control sera
    (uninfected animals).

    The chromatographic curve
    presented up to 5 peaks, representing polypeptides with a molecular weight of
    2000, 400, 150, 29 and less than 29 kDa, according to the interpolation with a
    standard curve of commercial polypeptide molecular weights. The results
    obtained with SDS-PAGE and WB using sera from the three species, indicated that
    those fractions of 400, 150, 29 and <29 kDa contained polypeptides,
    specifically recognized only by infected animals. When these fractions were
    evaluated with sheep, horse and swine sera by means of ELISA, the most efficient
    fraction was the 29 kDa, exhibiting an average sensitivity and specificity of
    94.5% and 93.5%, respectively in the three species. The SDS-PAGE and WB assay
    of this fraction showed the presence of two immunoreactive bands, a 29 kDa and
    another of 14 kDa.

    According to these results,
    it is concluded that the polypeptides contained in the 29 kDa chromatographic
    fraction would be suitable specific antigens, since they discriminate between
    infected and non infected F. hepatica animals. This fraction was also efficient
    in diagnosing fasciolosis in the prepatent stage of the infection in sheep.
    Therefore this fraction should be further studied and purified as it
    constitutes a prominent immunodiagnostic fraction which may be used for mass
    screening studies of fasciolosis using an ELISA test.

    Key words: fasciolosis, diagnosis, SDS-PAGE,
    Western Blot, ELISA.

    INTRODUCCION

    La fasciolosis en Chile ha
    desplazado a la hidatidosis como la zoonosis de mayor prevalencia en los
    animales de abasto beneficiados en los mataderos controlados por los servicios
    de salud. Su agente etiológico, Fasciola hepatica, es el único tremátodo
    de importancia médico-veterinaria y de salud pública en nuestro país.

    La infección por el
    parásito se presenta a lo largo de todo el territorio nacional, con la sola
    excepción de la XII Región. Las zonas más afectadas son las ubicadas entre la
    IV y X Regiones (Chile, 1989).

    La mayor importancia de
    esta parasitosis radica fundamentalmente en que reduce la productividad de los
    animales. Así por ejemplo, se ha estimado que un animal puede producir menos
    carne debido a que consume en promedio un 15% menos de alimento (Ferre y col.,
    1994).

    El examen coprológico se
    utiliza rutinariamen- te en los animales como método diagnóstico, sin embargo,
    no logra detectar el 100% de los casos infectados (Gorman y col., 1991).
    Además, no es útil para diagnosticar la etapa prepatente de la infección (fase
    aguda), ya que los parásitos por ser inmaduros no producen huevos (Zimmerman y
    col., 1982). Otro procedimiento diagnóstico, pero inespecífico, es la medición
    de enzimas celulares tales como son la transaminasa glutámica oxalacética, la
    aspartato aminotransferasa y la sorbitol dehidrogenasa, cuyos niveles aumentan
    en el período prepatente de la infección, pudiendo dar una evidencia
    circunstancial y no específica sobre la presencia de F. hepatica (Sykes
    y col., 1980; Hawkins, 1984; Ferre y col., 1994). También se ha descrito como
    procedimiento diagnóstico inespecífico la medición de la respuesta inmune
    celular expresada por una eosinofilia periférica (Hillyer, 1993). Al respecto
    se ha descrito que la proteína básica mayor, derivada de eosinófilos, tiene in
    vitro un elevado efecto destructor de fasciolas (Meeusen y col., 1995).

    Investigaciones recientes
    en busca de alternativas diagnósticas más eficientes y de aplicación a gran
    escala han demostrado que con las técnicas inmunológicas se puede realizar un
    diagnóstico temprano de la parasitosis.

    Esto tiene el beneficio de
    permitir adelantar las medidas de control a fechas oportunas para evitar que
    los parásitos puedan contaminar los hábitats de los caracoles huéspedes
    intermediarios con sus huevos.

    La prueba de ELISA es la
    que ha probado ser la más eficiente en el diagnóstico de las infecciones por F.
    hepatica.
    Sin embargo, si se lograra purificar de los extractos antigénicos
    aquellas fracciones de mayor sensibilidad y especificidad contra las formas
    maduras e inmaduras del parásito, esta eficiencia aumentaría aún más (Gorman y
    col., 1991).

    Un método que se ha usado
    bastante en investigación y para confirmar el resultado de una prueba de ELISA
    es la electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) y su posterior
    Western Blot (WB) (Tsang y col., 1983; Margni y Malchiodi, 1989). Mediante
    SDS-PAGE y posterior WB se han identificado polipéptidos de bajo peso molecular
    que son sensibles y específicos para F. hepatica.

    En el presente trabajo se
    pretende continuar con la caracterización antigénica de este parásito, semipurificando
    aquellos polipéptidos que han demostrado ser inmunológicamente relevantes
    (Gorman y col., 1991), para luego mediante ELISA evaluar el comportamiento
    de ellos en animales infectados.  

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