Evaluación diagnóstica de fracciones cromatográficas de Fasciola hepatica mediante Western Blot y ELISA en animales infectados
Publicación original: Arch. med. vet., 1997, vol. |
RESUMEN: La fasciolosis causada por Fasciola
hepatica se diagnostica rutinariamente mediante el examen coprológico.
Debido a que este examen no es 100% sensible y además es ineficaz en la etapa
pre-patente, se realizó este trabajo con el objeto de caracterizar y
seleccionar fracciones antigénicas de valor diagnóstico de extractos de
excreción-secreción del parásito.
Se utilizó cromatografía de
exclusión por tamaño molecular (Sephacryl S-300), electroforesis en geles de
poliacrilamida en ambiente reductor (SDS-PAGE) y posterior western blot (WB),
además de un método de "enzyme-linked immuno-sor-bent assay" (ELISA)
en microplaca. Para evaluar el valor diagnóstico de los antígenos se usaron
sueros de las especies ovina, porcina y equina en tres estados (sanos, con
otras parasitosis y naturalmente infectados con F. hepatica).
Mediante el método
cromatográfico se obtuvieron hasta 5 "peaks", que interpolados en una
curva patrón representaron polipéptidos de pesos aproximados de 2.000, 400,
150, 29 y menores a 29 kDa. De éstos, los inmunorreactivos específicos para la
enfermedad en las tres especies animales, bajo los criterios de SDS-PAGE y
posterior WB, fueron los de 400, 150, 29 y <29.
La evaluación mediante
ELISA en microplaca, de estas fracciones con los sueros de las tres especies
animales infectadas, indicó que la fracción de 29 kDa ofreció valores de
sensibilidad y especificidad de 94.5% y 93.5%, respectivamente. Similares
valores de sensibilidad y especificidad se determinaron al enfrentar esta
fracción antigénica con sueros de ovinos en la etapa prepatente de la
infección. Esta misma fracción analizada por el criterio de SDS-PAGE y luego
por WB dio dos bandas de reconocimiento específico, una de 29 kDa y otra de 14
kDa aproximados. Con estos resultados concluimos que la fracción cromatográfica
de 29 kDa sería capaz de discriminar en las especies ovina, porcina y equina,
entre aquellos animales sanos, con otras parasitosis y con fasciolosis. Además
fue también eficiente para diagnosticar la infección en etapa prepatente en
ovinos. Por ello se constituye en una fracción promisoria para ser purificada y
empleada en estudios epidemiológicos mediante ELISA.
Palabras claves: fasciolosis, diagnóstico,
SDS-PAGE, Western Blot, ELISA.
SUMMARY: Diagnostic evaluation of
chromatographic fractions of Fasciola hepatica by Western Blot and ELISA
in infected animals
The antigenic components of
excretory-secretory products of adult F. hepatica, were separated by gel
filtration chromatography (Sephacryl S-300) and then analized by polyacrylamide
gel electrophoresis (SDS-PAGE), followed by Western Blot (WB). In order to
evaluate the sensitivity, specificity and predictive value of the selected
fractions an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used with sera from
sheep, swine and horses infected with F. hepatica, as well as with control sera
(uninfected animals).
The chromatographic curve
presented up to 5 peaks, representing polypeptides with a molecular weight of
2000, 400, 150, 29 and less than 29 kDa, according to the interpolation with a
standard curve of commercial polypeptide molecular weights. The results
obtained with SDS-PAGE and WB using sera from the three species, indicated that
those fractions of 400, 150, 29 and <29 kDa contained polypeptides,
specifically recognized only by infected animals. When these fractions were
evaluated with sheep, horse and swine sera by means of ELISA, the most efficient
fraction was the 29 kDa, exhibiting an average sensitivity and specificity of
94.5% and 93.5%, respectively in the three species. The SDS-PAGE and WB assay
of this fraction showed the presence of two immunoreactive bands, a 29 kDa and
another of 14 kDa.
According to these results,
it is concluded that the polypeptides contained in the 29 kDa chromatographic
fraction would be suitable specific antigens, since they discriminate between
infected and non infected F. hepatica animals. This fraction was also efficient
in diagnosing fasciolosis in the prepatent stage of the infection in sheep.
Therefore this fraction should be further studied and purified as it
constitutes a prominent immunodiagnostic fraction which may be used for mass
screening studies of fasciolosis using an ELISA test.
Key words: fasciolosis, diagnosis, SDS-PAGE,
Western Blot, ELISA.
INTRODUCCION
La fasciolosis en Chile ha
desplazado a la hidatidosis como la zoonosis de mayor prevalencia en los
animales de abasto beneficiados en los mataderos controlados por los servicios
de salud. Su agente etiológico, Fasciola hepatica, es el único tremátodo
de importancia médico-veterinaria y de salud pública en nuestro país.
La infección por el
parásito se presenta a lo largo de todo el territorio nacional, con la sola
excepción de la XII Región. Las zonas más afectadas son las ubicadas entre la
IV y X Regiones (Chile, 1989).
La mayor importancia de
esta parasitosis radica fundamentalmente en que reduce la productividad de los
animales. Así por ejemplo, se ha estimado que un animal puede producir menos
carne debido a que consume en promedio un 15% menos de alimento (Ferre y col.,
1994).
El examen coprológico se
utiliza rutinariamen- te en los animales como método diagnóstico, sin embargo,
no logra detectar el 100% de los casos infectados (Gorman y col., 1991).
Además, no es útil para diagnosticar la etapa prepatente de la infección (fase
aguda), ya que los parásitos por ser inmaduros no producen huevos (Zimmerman y
col., 1982). Otro procedimiento diagnóstico, pero inespecífico, es la medición
de enzimas celulares tales como son la transaminasa glutámica oxalacética, la
aspartato aminotransferasa y la sorbitol dehidrogenasa, cuyos niveles aumentan
en el período prepatente de la infección, pudiendo dar una evidencia
circunstancial y no específica sobre la presencia de F. hepatica (Sykes
y col., 1980; Hawkins, 1984; Ferre y col., 1994). También se ha descrito como
procedimiento diagnóstico inespecífico la medición de la respuesta inmune
celular expresada por una eosinofilia periférica (Hillyer, 1993). Al respecto
se ha descrito que la proteína básica mayor, derivada de eosinófilos, tiene in
vitro un elevado efecto destructor de fasciolas (Meeusen y col., 1995).
Investigaciones recientes
en busca de alternativas diagnósticas más eficientes y de aplicación a gran
escala han demostrado que con las técnicas inmunológicas se puede realizar un
diagnóstico temprano de la parasitosis.
Esto tiene el beneficio de
permitir adelantar las medidas de control a fechas oportunas para evitar que
los parásitos puedan contaminar los hábitats de los caracoles huéspedes
intermediarios con sus huevos.
La prueba de ELISA es la
que ha probado ser la más eficiente en el diagnóstico de las infecciones por F.
hepatica. Sin embargo, si se lograra purificar de los extractos antigénicos
aquellas fracciones de mayor sensibilidad y especificidad contra las formas
maduras e inmaduras del parásito, esta eficiencia aumentaría aún más (Gorman y
col., 1991).
Un método que se ha usado
bastante en investigación y para confirmar el resultado de una prueba de ELISA
es la electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) y su posterior
Western Blot (WB) (Tsang y col., 1983; Margni y Malchiodi, 1989). Mediante
SDS-PAGE y posterior WB se han identificado polipéptidos de bajo peso molecular
que son sensibles y específicos para F. hepatica.
En el presente trabajo se
pretende continuar con la caracterización antigénica de este parásito, semipurificando
aquellos polipéptidos que han demostrado ser inmunológicamente relevantes
(Gorman y col., 1991), para luego mediante ELISA evaluar el comportamiento
de ellos en animales infectados.
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