Caracterización de las glicoproteínas de una cepa de virus respiratorio sincicial aislada en Cali

• Materiales y
  metodos
• Discusion
• Referencias

RESUMEN: Se empleó un aislado
de virus
respiratorio sincicial de un niño de dos meses de edad que
presentó el primer episodio de infección aguda en
un estudio longitudinal efectuado en Cali (1986-1990), para
caracterizar molecular y antigénicamente las
glicoproteínas virales que son importantes en los
mecanismos de inmunopatogénesis en la infección
respiratoria aguda generada por este tipo de virus. La
caracterización electroforética de proteínas
radiomarcadas in vitro con [3H]-Glucosamina permitió
evidenciar las bandas de 98, 70, 30 kd como glicoproteínas
que hacen parte de la envoltura del virus. La gp 70 es importante
en la inmunopatogénesis porque aparece como efecto de
protección de tipo IgG transmitida pasivamente por la
madre. Se pudieron localizar dos sitios para la proteasa V8 en la
gp70 aislada de ambas cepas. La F1 es una de las subunidades
comprometidas en la generación de una respuesta inmune de
tipo neutralizante determinada en sueros de la fase aguda y en
hiperinmunes de conejo. Se demostró la similitud
antigénica y estructural de la cepa Cali-0015 con la cepa
de referencia Long.

Palabras claves: Virus sincicial. Glicoproteínas
virales.

Infecciones respiratorias.

El virus respiratorio sincicial (VRS), miembro del
género
Neumovirus, familia
Paramyxoviridae, es la causa más importante de
pneumonías y bronquiolitis de origen viral en niños
menores de 2 años. De esta forma produce reinfecciones
comunes en presencia de anticuerpos neutralizantes transferidos
pasivamente1.

Los mecanismos de patogénesis e inmunidad a la
infección por VRS aún no son claros. Es posible que
ciertas reacciones inmunopatológicas de tipo IgE
específicas puedan potencializar el daño
causado por la replicación del virus en el tracto
respiratorio de infantes. Esto ha impedido que se pueda
desarrollar una vacuna eficaz a pesar de la existencia de un solo
serotipo viral2,3.

Un estudio longitudinal de infección respiratoria
aguda efectuado en Cali desde 1986 hasta 1990, mostró que
el VRS es el principal agente viral causante de la
infección respiratoria aguda (IRA) en niños menores
de un año (63% de los virus aislados)4,5.
Estudios posteriores con respecto a la epidemiología del
virus han demostrado su importancia como agente etiológico
del cuadro clínico6.

Aunque se han realizado numerosos estudios para
caracterizar estructural y funcionalmente los polipéptidos
del virión, su identificación todavía no es
completa. En general se describen en la literatura de 7 a 10
polipéptidos cuyas masas moleculares relativas (Mr)
varían entre 10 a 200 kd7-9. Las
glicoproteínas G y F participarían en la
inmunoprotección durante el proceso de
infección y enfermedad.

Los diferentes aislamientos del VRS, en general, se han
clasificado en dos grupos si se
tienen como criterio de caracterización, su reactividad
diferencial contra anticuerpos monoclonales. Los miembros de
estos dos grupos difieren en sus propiedades inmunológicas
por lo menos en 4 proteínas estructurales, sobre todo en
las glicoproteínas de la
envoltura10.

En este trabajo se
analizaron, mediante electroforesis, las glicoproteínas de
la envoltura de los viriones del VRS y se valoró
su inmunorreactividad en la técnica inmunoblot con sueros
tanto monoclonales como policlonales obtenidos de conejos y de
pacientes en distintos períodos del proceso de
infección. Además se realizaron experimentos de
fragmentación peptídica en la proteína de 70
kd de la cepa prototipo Long y de una cepa geográfica
aislada de un niño con infección respiratoria en
Cali.

MATERIALES Y METODOS

Cepas del virus. La cepa de VRS prototipo Long (subtipo
A) ATCC-VR-26 se obtuvo en la American Type Culture Collection
(Rockville, MD); el aislamiento geográfico, IRA 0015, se
consiguió de un aspirado nasofaríngeo del primer
episodio de IRA en un niño de dos meses de nacido
perteneciente a la cohorte de un estudio longitudinal sobre IRA
efectuado en Cali (1986-1990)4. Ambas cepas se
reactivaron mediante 15 pases sucesivos en células
Hep-2, tituladas y almacenadas a -70 º C para su posterior
utilización.

Sueros. Se emplearon los siguientes tipos de sueros:
Suero humano correspondiente a la fase aguda del cuadro
clínico de IRA donde se aisló el virus 0015; suero
humano del período convaleciente al cuadro clínico
de IRA causado por el aislamiento 0015; sueros hiperinmunes de
conejo anti-RSV aislado 0015 (cepa Cali) y cepa prototipo Long; y
anticuerpos monoclonales específicos de subtipo, Mab
92-11c específico para subgrupo E (proteína F) que
fueron cedidos gentilmente por el Dr. L. Anderson del CDC en
Atlanta, USA.

Cultivo de los virus. Los virus se replicaron por
infección de monocapas de células Hep-2 con un
inóculo de 100 U TCID50,/1ml, hasta obtener un efecto
citopático de 80% en la monocapa (cuarto día de
cultivo). Se utilizó medio mínimo esencial sin
suero fetal bovino, suplementado con L-Glutamina (400 mM) y una
mezcla de antibióticos (penicilina/estreptomicina 100U/100
µg/ml).

Protocolos de purificación del virus. Se
aplicaron los protocolos
descritos inicialmente por Fernie y Gerin11 y
Levine12 con algunas modificaciones. La
purificación de cada uno se inició de los virus
obtenidos en el crecimiento de 30 frascos de 40 cm2 de
monocapas de células Hep-2 que presentaban efectos
citopáticos de 80%, las células se removieron
mediante el raspado de la monocapa con varillas de vidrio y se
resuspendieron en 5 ml de solución amortiguadora (MHN).
Después de centrifugación, el sobrenadante se
ensayó en pruebas de
titulación por TCID5013. La
concentración de proteínas en cada ensayo se
determinó por el método de
Harlow y Lane14.

Los viriones se purificaron después de dos ciclos
de ultracentrifugación en gradientes isopícnicos de
sacarosa con colchones de 60% a 120,000xg 4 horas a 4º C
mediante un rotor TH641 (Sorvall-Dupont). Se aisló la
banda opalescente observada en la interfase del colchón
que luego se ensayó según lo descrito en el
párrafo
anterior, con el fin de determinar la presencia y
concentración de viriones en cada ensayo.

Las proteínas de las dos cepas de VRS estudiadas
se separaron mediante electroforesis de proteínas en geles
de poliacrilamida. Algunos experimentos se efectuaron en
condiciones reductoras y se adicionó 2-Mercaptoetanol;
mientras que en otros casos se usaron condiciones no reductoras,
para seguir la técnica de Laemmli15 modificada
por Studier16.

Las distintas fracciones de glicoproteínas de las
envolturas del virión, se estudiaron por marcación
en cultivos celulares infectados en pulsos con
[3H]-Glucosamina, después de las fracciones
obtenidas mediante electroforesis, se sometieron a
fluorografía de acuerdo con Harlow y Lane14. En
todos los casos las bandas de proteínas se visualizaron
por tinción con nitrato de plata.

Inmunoblot. Las diversas proteínas obtenidas de
las preparaciones purificadas en cada una de las cepas
estudiadas, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa
mediante la metodología descrita por Towbin et
al.17; la transferencia se efectuó al aplicar
una diferencia de potencial de 50 V durante 18 horas en un
aparato transferidor (Bio-Rad). La determinación de las
correspondientes bandas inmunorreactivas se hizo con
proteína A radiomarcada con 125I.

Fragmentación proteolítica. La banda de 70
kd de cada una de las cepas estudiadas, se purificó por
electroelución a partir de geles de
poliacrilamida18, que se dializaron de acuerdo con lo
descrito por Sambrook et al.19 Las bandas purificadas
mediante el procedimiento
anterior, se sometieron a digestión proteolítica
con la proteasa V8 de Staphylococcus y la tripsina tipo II
(Sigma) directamente en el gel de apilamiento. La reacción
se efectuó durante una hora; una vez cumplido este
tiempo se
inició la corrida del correspondiente gel. Las bandas
obtenidas por la digestión con cada una de las proteasa,
se visualizaron por tinción con nitrato de
plata14 o mediante fluorografía.