Efecto de la heparina en la capacidad fecundante in vitro de espermatozoides caprinos
Publicación original: |
RESUMEN: El presente estudio
está destinado a establecer la etapa del proceso de
fecundación en que la heparina ejerce el
efecto estimulatorio de la fecundación en
caprinos.
Oocitos bovinos fueron madurados en medio 199 y
alternativamente utilizados para la producción de zonas pelúcidas
solubilizadas o para estudios de fecundación. Las zonas
pelúcidas, colectadas eliminando mecánicamente al
oocito, fueron solubilizadas en ácido acético,
liofilizadas y almacenadas a -20° C, hasta su
reconstitución. Los espermatozoides fueron colectados con
vagina artificial, lavados y capacitados por incubación en
medio Talp con suero y heparina.
En el Experimento 1, los espermatozoides fueron
suspendidos en Talp más heparina, Talp más heparina
y zonas pelúcidas o en condiciones no capacitantes y
fueron incubados por 90 min a 39° C y 5% de CO2 en aire. En el
Experimento 2, los espermatozoides agrupados como en el
experimento anterior fueron coincubados por 18 h con oocitos. En
el Experimento 3, los espermatozoides fueron suspendidos en
plasma seminal y Talp con y sin heparina e incubados por 90 min a
los 0, 45 y 90 min, muestras de suspensión fueron
expuestas a zonas solubilizadas e incubadas por otros 30 min. En
los experimentos 1 y
3, el daño
acrosomal fue evaluado usando la tinción PI/PSA y en el
Experimento 2, la fecundación fue verificada por la
presencia de pronúcleos y cola espermática en el
oocito.
Los resultados en el Experimento 1 muestran que a los 90
min de incubación el daño acrosomal aumenta en los
espermios tratados con
zonas en relación a los controles (P< 0.001). En el
Experimento 2. sólo hubo fecundación en los
grupos
espermáticos incubados en condiciones capacitantes. En el
Experimento 3, los resultados muestran que el daño
acrosomal aumenta ya a los 45 min de incubación
(P<0.01).
Palabras claves: heparina, capacitación espermática,
caprinos.
SUMMARY: Effect of heparin on the in vitro
fertilizing ability of goat spermatozoa as assessed
by heterologous solubilized zona pellucidae.
Heparin has been shown to improve the fertilizing
ability of goat spermatozoa in a dose-dependent manner. The
present study assessed the mechanism involved in the stimulatory
effect by using solubilized zona pellucidae from
bovines.
Bovine cumulus-oocyte complexes were matured in 199 plus
serum and insuline. Thereafter, oocytes were denuded from
granulosa cells and used either to obtain zona pellucidae or for
fertilization. Free zonae were collected by mechanical means,
solubilized in heated acetic acid, liofilized and stored at
-20° C until their reconstitution in Talp plus
serum.
In Experiment 1, spermatozoa were suspended either in
non-capacitated conditions or in Talp plus heparin and Talp plus
heparin and zonae, and incubated for 90 min at 39° C in 5%
CO2 in air. In Experiment 2, spermatozoa were grouped as before
and co-incubated with matured oocytes for 18 hr to assess their
fertilizing ability. In Experiment 3, spermatozoa were suspended
either in seminal plasma, Talp plus heparin or Talp without
heparin for 90 min. At 0, 45 and 90 min, semen samples were
exposed to solubilized zonae and were further incubated for 30
min. Acrosome disruption in Experiment 1 and 3 was assessed by
staining spermatozoa with PI/PSA. Fertilization in Experiment 2
was verified by the presence of pronuclei and sperm
tail.
The results in Experiment 1 showed that the acrosome
disruption rate increased above the control groups
after 90 min of incubation only in zonae-treated spermatozoa
(P<0.001). In Experiment 2, fertilization was seen only when
spermatozoa were previously incubated in conditions known to
capacitate them. In Experiment 3, the results showed that the
acrosome disruption rate first increased when spermatozoa were
exposed to zonae after 45 min of incubation
(P<0.01).
The cumulative results suggest that heparin improves
fertilization by stimulating sperm capacitation. The effect is
expressed after 45 min of sperm incubation.
Key words: heparin, sperm capacitation,
goats.
INTRODUCCION
La heparina ha demostrado mejorar la capacidad
fecundante in vitro de espermatozoides de bovinos (Parrish
y col., 1989), ovinos (Cox y col., 1992) y caprinos (Cox y col.,
1995). En bovinos, la heparina facilita la capacitación
espermática de espermatozoides eyaculados,
uniéndose a residuos sulfatos (Miller y Ax, 1989) y
probablemente removiendo factores decapacitantes adheridos a la
membrana plasmática, tales como proteínas
fijadoras de calmodulina (Leclerc y col., 1992; Therien y col.,
1995).
Para demostrar el efecto de la heparina en la
capacitación espermática en bovinos, Parrish y
col., (1989) utilizaron lisofosfatidilcolina, un lípido
fusogénico capaz de desencadenar la reacción de
acrosoma sólo en espermios capacitados. Más
recientemente, Florman y col. (Florman y First, 1988; Florman y
col., 1990) utilizaron zonas pelúcidas solubilizadas para
evaluar el estado
funcional de espermatozoides de bovinos. La solubilización
de las zonas pelúcidas permite la liberación a la
solución de ZP3, glicoproteína estructural de la
zona pelúcida, responsable de la fijación
espermática y de la inducción de la reacción de acrosoma
a nivel de la zona pelúcida (Wassarman, 1987). Como
sólo los espermios capacitados son capaces de ligar ZP3,
la adición de zonas pelúcidas solubilizadas a
preparaciones espermáticas en asociación con una
evaluación de la integridad acrosomal,
constituye un modelo
útil para la identificación fisiólogica del
estado
funcional de los espermatozoides.
En caprinos, la heparina aumenta la capacidad fecundante
in vitro de los espermatozoides, siguiendo un patrón
dosis-respuesta que se asemeja para los distintos machos (Cox y
col., 1995). En el mismo estudio se mostró que el efecto
en la capacidad fecundante toma un tiempo
mínimo que se aproxima a una hora y que la eficiencia es
influida por la actividad biológica de la heparina. El
objetivo del
presente trabajo fue
precisar el efecto de la heparina en la función
fecundante de los espermatozoides caprinos.
Página siguiente  |