Utilización de lectina Pisum sativum y yoduro de propidio para la evaluación rápida de integridad de acrosoma en espermatozoides caprinos
RESUMEN: La lectina Pisum sativum (PSA) ha sido
usada exitosamente como marcador de glicoconjugados localizados
en la membrana acrosomal interna, pero debido a las variaciones
en los constituyentes de membranas existentes entre especies, su
utilización requiere una validación preliminar. Este
estudio compara los resultados obtenidos en la tinción
acrosomal con una combinación de yoduro de propidio (PI) y
PSA con la tinción Rosa de Bengala que se utiliza
corrientemente como estándar, y además compara la
interpretación de los
resultados obtenidos con la tinción PI/PSA por dos
evaluadores independientes.
En el experimento 1, semen de chivos fue colectado por
vagina artificial, lavado del plasma seminal y teñido
comparativamente con PI/PSA y con Rosa de Bengala, inicialmente
en forma directa después de la colección y
posteriormente luego de preparar fracciones con diferente
proporción de espermatozoides vivos y muertos. En el
experimento 2, semen de diferentes chivos congelado a -196°
C en el diluyente a base de Tris, citrato y yema de huevo, fue
descongelado a 37° C por 30 seg ó a 65° C por 5
seg y los espermatozoides fueron teñidos con PI/PSA. La
interpretación de los resultados de integridad de acrosoma
fue realizada por dos evaluadores independientes. Para comparar
los resultados los porcentajes fueron transformados y las medias
y correlaciones fueron calculadas por medio del paquete
estadístico Systat®.
Los resultados muestran que la tinción PI/PSA y
Rosa de Bengala da resultados similares y positivamente
correlacionados (r = 0.99) y que la interpretación de los
evaluadores también fue positivamente correlacionada (r =
0.98). De acuerdo a lo anterior, se concluye que la tinción
PI/PSA es útil para la evaluación rápida de
integridad de acrosoma en caprinos.
SUMMARY: Use of propidium ioide and Pisum sativum
for fast assessment of acrosome
integrity in goat spermatozoa
Lectins are used for studies in mammalian sperm surface
and organelles because of their ability to specifically link
sugar residua. Fluorescein labeled Pisum sativum (PSA) has
been used successfully in several mammalian spermatozoa, as a
marker of the inner acrosomal membrane but, because of
interspecific variations in membrane constituents, its use
requires a preliminary validation. This study compared the
results obtained by staining goat spermatozoa with a combination
of propidium ioide (PI) and PSA vs those of Bengal Red. Also the interpretation of the results
achieved were compared with the results obtained by two external
technicians.
In Experiment 1, goat spermatozoa collected by
artificial vagina were washed once, immediately after collection,
and stained with PI/PSA and Bengal Rose. Then, to prepare sperm
groups with different proportions of live and dead sperm,
spermatozoa were fractionated and one fraction was damaged by
freezing at -196° C without cryoprotectans. In Experiment 2,
semen from different males was frozen in a Tris-base d extender,
and thawed either at 37° C for 30 sec or at 65° C for 5
sec, and then stained with PI/PSA. Two independent technicians
assessed the results of both series of experiments. Percentage
transformations, media comparison and correlation were obtained
by using the Systat® computing
package.
The results showed that PI/PSA and Bengal Rose gave
similar and positively correlated results and that both
technicians gave similar interpretations (r = 0.98). It can be
concluded that PI/PSA is a useful staining for fast assessment of
goat spermatozoa.
Palabras claves: espermatozoides, lectinas,
acrosoma, caprinos.
Key words: spermatozoa, lectins, acrosome,
goats.
Introducción
El acrosoma es un organelo espermático que cumple
una función esencial en el
proceso de fecundación. Está
revestido externamente por el plasmalema y la membrana acrosomal
externa e internamente por la membrana acrosomal interna
(Bedford, 1990). La importancia funcional del acrosoma se debe a
su rol en la fijación y penetración espermática de
la zona pelúcida y en la fusión entre gametos
(Yanagimachi, 1988). Aun cuando la membrana acrosomal interna es
bastante resistente, la doble membrana que constituye la pared
acrosomal puede alterarse fácilmente por efectos
fisiológicos (ej. reacción de acrosoma) o no
fisiológicos (ej. degeneración, daño
físicoquímico).
La evaluación de la integridad de acrosoma ha sido
relevante, tanto desde un punto de vista clínico y
tecnológico como desde la investigación de la biología espermática (Bavister,
1990;Cross y Meizel, 1989), por lo que en especies con un
acrosoma relativamente poco notorio, como en rumiantes
domésticos, se han desarrollado diversas técnicas para facilitar su
identificación.
Teniendo presente las variaciones entre especies, los
procedimientos tintoriales
estándares han mostrado ser bastante útiles, pero a su
vez son laboriosos, demandantes de tiempo y a veces sus
resultados son algo ambiguos (Cross y Meizel, 1989).
Recientemente se ha incorporado la utilización de
lectinas asociadas a fluoresceínas como marcadores de
acrosoma y de modificaciones plasmáticas en espermios
eyaculados (Cummins, 1995; Medeiros y Parrish, 1996). Las
lectinas son glicoproteínas que se unen específicamente
a terminales azúcares ubicados en las estructuras celulares y, por
lo mismo, se han utilizado como marcadores específicos de
glicoconjugados localizados, tanto en el acrosoma intacto como en
la matriz acrosomal (Cross y
col., 1986; Nolan y col., 1992; Way y col., 1995). La lectina
Pisum sativum (PSA) permite reconocer terminales manosa, glucosa y glucosamina
(Goldstein y Portez, 1986) de glicoconjugados localizados en la
matriz acrosomal, por lo que asociada a una fluoresceína
puede identificar espermatozoides con el acrosoma dañado o
ausente (Nolan y col., 1992; Aitken y Brindle, 1993). El yoduro
de propidio (PI) es una tinción nuclear y por lo mismo sirve
como tinción espermática de contraste. En
combinación, permiten una evaluación rápida,
simple y sin ambigüedad de la presencia o ausencia del saco
acrosomal.
En general, las pruebas espermáticas
ideales deberían ser sencillas, rápidas de interpretar,
confiables, repetibles y debieran aportar información relevante
(Bavister, 1990). La gran utilidad del uso de lectinas en
la evaluación funcional de espermatozoides es que cumplen la
mayor parte de estos requisitos (Kawakami y col., 1993), por lo
que se han utilizado crecientemente en estudios de la
biología espermática.
Como marcador de la función acrosomal, la lectina
PSA se ha utilizado exitosamente en toros (Nolan y col., 1992;Way
y col., 1995), potros (Farlin y col., 1992; Casey y col., 1993) y
perros (Kawakami y col., 1993;
González-Chábarri y col., 1994), mientras que en muchas
clínicas humanas se ha empezado a utilizar en conjunto con
la lectina Arachis hipogea (PNA) como técnica de
elección para la evaluación acrosomal (Kinger y
Rajalakshmi, 1995). El presente trabajo tiene por función
describir la utilización de la combinación de PI y PSA
ajustada para la evaluación de integridad de acrosoma en
caprinos.
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