Protocolo comparativo de purificación de la enzima glutamil

Introducción
histórica

La enzima ?-glutamil-transpeptidasa (GGT ó GGTP)
fue descrita en riñón de oveja por primera vez en
1950 (Hanes et al). Según este grupo
investigador, dicha enzima era capaz de catalizar la
transpeptidación de grupos ?-glutamil en aceptores de
aminoácidos y péptidos, en presencia de sustrato.
Con posterioridad se demostró que el sustrato de
hidrólisis era paulatinamente inhibido conforme progresaba
la transpeptidación, al incrementarse la
concentración de dichos aceptores. La ?-glutamil
transpeptidasa cataliza la reacción de transferencia de
los grupos ?-glutamil del glutathión y de otros
péptidos ?-glutamil a receptores tales como
aminoácidos, formando así compuestos ?-glutamil. Se
trata de una transferasa localizada en la membrana celular que
está presente en la mayoría de los órganos
parenquimatosos.

Una enzima con características similares fue
también identificada en 1960 a partir de tejidos humanos,
por Orlowski y Szewszuk. En esa misma década fue descrita
en diferentes órganos, tejidos y fluidos de animales de
laboratorio, como hígado, riñón,
páncreas, pulmón, bilis, orina, suero, incluso en
los eritrocitos (Goldbarg et al, 1963; Orlowski y
Meister, 1965). Aunque es similar su distribución
orgánica en los diferentes animales, no es exactamente
igual, y tiende a encontrarse con preferencia en determinados
tejidos dependiendo de la especie (Braun et al, 1983).
Aunque su actividad máxima parece ser renal, ello no es
óbice para que clínicamente su determinación
sea en casos de enfermedad hepática, de ahí que sea
la enzima de mayor sensibilidad para test
hepáticos.

La actividad de la enzima en el suero de pacientes con
daño hepático fue investigada por Szczeklin et
al en 1961. Sus hallazgos fueron corroborados por el grupo
de Pineda, Goldbarg y Rutenburg, atribuyéndole importancia
en el diagnóstico de la enfermedad hepatobiliar
pancreática y confirmando la elevación de la enzima
en el suero de pacientes caracterizados por un cuadro con
afección hepatobiliar y pancreática (Rutenburg
et al, 1963); estos completaron el estudio realizando el
diagnóstico de la patología mediante un examen
microscópico tisular. Aparte, esta enzima fue evaluada en
relación con episodios de daño isquémico
cardiaco post-infarto (Agostini et al, 1965;
Hedworth-Whitty et al, 1967; Ravens et al,
1969).

Mediante la identificación de esta enzima en
suero se puede describir la obstrucción hepática y
diferenciarla de un proceso meramente inflamatorio, en un caso de
patología infecciosa (Aronsen et al, 1965) o
neoplasia (Aronsen et al, 1970). Villa et al
(1966), pronosticaron la actividad de la enzima en concordancia
con sus niveles séricos en dos enfermedades
hepáticas: a) la toxicidad hepática debida a
tetracloruro de carbono producía un leve aumento de
ésta; b) en la hepatitis viral, pese a que se halla poco
incrementada la enzima en la primera etapa de la enfermedad,
alcanza un valor máximo durante la fase de
recuperación clínica.

Es importante recordar que, al ser una enzima presente
en la membrana del hepatocito, se eleva antes que otras en caso
de daño hepático. Según Zein et al
(1970), no se trata de una enzima específica de
hígado sensu stricto, es útil en
alteraciones derivadas de la ingesta de alcohol, y es
confirmatoria de hepatomas primarios y secundarios, en ausencia
de ictericia.

Breve
descripción de la enzima. Interés en el
diagnóstico de patologías

La ?-glutamil-transpeptidasa es una enzima transferasa
situada en la membrana celular, presente en la mayoría de
los órganos de tipo parenquimatoso; es más
abundante en hígado, vías biliares y
páncreas. La deficiencia de esta enzima se caracteriza por
el aumento de la concentración de glutathión en
plasma y orina. Al igual que la fosfatasa alcalina
sérica (FAS), sirve de indicador en casos de colestasia.
Su función es la transferencia de grupos ?-glutamil entre
péptidos (p.ej. de glutathión a otros
péptidos o aminoácidos).

Como ya se ha dicho con anterioridad, la GGT está
presente en las membranas celulares de muchos tejidos, incluyendo
los riñones, el conducto biliar, páncreas,
hígado, bazo, corazón, cerebro, y vesículas
seminales, como ocurre también con las transaminasas y la
lactato-deshidrogenasa (LDH). Está involucrada en la
transferencia de aminoácidos a través de la
membrana celular y en el metabolismo de los leucotrienos. La
enzima juega un papel clave en el ciclo de la ?-glutamil, una
vía para la síntesis y degradación de
glutathión y de destosificación de drogas y
xenobióticos. Su papel principal radica en el metabolismo
del glutathión mediante la transferencia de la
fracción ?-glutamil a una variedad de moléculas
aceptoras como el agua, algunos L-aminoácidos y
péptidos, dejando el producto cisteína para
preservar la homeostasis intracelular del estrés
oxidativo. Dicha reacción se resume:

(5-L-glutamil)-péptido +
aminoácido ? péptido + 5-L-glutamil

El rango normal en humanos va desde 0 a 30 UI/ml. Sus
niveles son similares en niños y adultos, y no se ven
afectados durante el embarazo. Si tenemos en cuenta otras
especies, los valores son diferentes: en bovinos está
entre 20 y 27 UI/ml; en perro entre 5-6 UL/ml; en caballo entre
15-17 UI/ml, y en pequeños rumiantes entre 32-35
UI/ml.

Su principal valor está en otorgarle
especificidad (origen hepático) a las elevaciones de
fosfatasas alcalinas. Sin embargo, hay otras causas que pueden
producir elevaciones de GGT en ausencia de enfermedad
hepática, como el consumo de ciertos medicamentos (p. ej.
anticonvulsivantes) y el consumo de alcohol. En ocasiones se han
detectado elevaciones esporádicas de GGT en pacientes
diabéticos.

La GGT tiene varios usos como marcador
diagnóstico en la clínica. Unos valores
séricos elevados pueden ser evidentes en enfermedades
hepáticas, pancreáticas y biliares. Su incremento,
unido al de la FAS sugiere una alteración a nivel biliar;
no se ha concretado aún cuál de las dos es
más sensible a daño colestásico. La utilidad
de la elevación de la GGT frente al de FAS yace en
descartar una patología a nivel óseo.

La GGT también se eleva posteriormente al consumo
excesivo de alcohol; una elevación aislada y
desproporcionada en comparación con el aumento de otras
enzimas hepáticas puede indicar abuso de alcohol o
hepatitis alcohólica. El aumento puede permanecer incluso
3-4 semanas después de la ingesta. El alcohol puede
aumentar la síntesis de GGT vía inducción
microsomal o la salida de la enzima directamente desde los
hepatocitos.

Hepatitis alcohólica,
evolución de varias enzimas, días 0-40
[Whitfield et al, 1972].

A modo de resumen, un incremento en los valores de la
GGT está relacionado con:- Tóxicos
hepáticos: en casos leves aumenta en pequeña
cuantía; en cuadros agudos presenta una elevación
superior a la que aparece en hepatitis crónicas y es
similar al nivel que habría de transaminasas.

– Hepatitis vírica aguda: la GGT aumenta menos
que las transaminasas, aunque es la última en volver a sus
niveles originales normales.

– Hepatitis crónica: se encuentra con una
elevación superior al de las transaminasas.

– Ictericia obstructiva: incremento más alto y
rápido que el de leucin-aminopeptidasa (LAP) y
FAS.

– Metástasis hepática: directamente
proporcional a su extensión y evolución. La
elevación puede ser moderada a alta.

– Pancreatitis aguda y crónica: sobretodo al
obstruir las vías biliares. También en casos de
nefrosis lipoidea y cáncer renal.

– Infarto de miocardio: a partir del 4º-5º
día se ve incrementada, estableciendo un pico
máximo el 10º día post-isquemia.

Trabajos
escogidos. Comentario crítico

– WU, Q.; XU, H.; ZHANG, L.; YAO, J. y OUYANG, P.
(2006). Production, purification and properties of
?-glutamyl-transpeptidase from a newly isolated Bacillus
subtilis NX-2. J Mol Cat B Enz 43,
113-117.

– SHUAI, Y.; ZHANG, T.; MU, W. y JIANG, B. (2011).
Purification and characterization of ?-glutamyl-transpeptidase
from Bacillus subtilis SK11.004. J Agric Food
Chem 59, 6233-6238.

El proceso de purificación y aislamiento de la
enzima GGT varía con dependencia de numerosas variables.
Entre ellas estaría el organismo del que se parte para
realizar la extracción (bacteria, hongo, etc.). Por
supuesto hay que valorar los conocimientos existentes en la
actualidad y los de hace cincuenta años, no es lo mismo
analizar un trabajo desarrollado en este sentido en los
años sesenta, como el de Orlowski y Meister (1965). De
ahí que el presente trabajo estudio se base en el
análisis de la enzima GGT a partir de una bacteria
concreta (Bacillus subtilis) y los trabajos de partida
sean relativamente recientes (2006 y 2011).

Las bacterias del género Bacillus spp.
presentan extracelularmente la enzima GGT. En el trabajo de Wu
et al (2006) se partió de muestras de tierra con
antecedentes de presencia de B. subtilis. Para
que estas bacterias produjeran la enzima, se les
suministró un medio de cultivo enriquecido con glucosa,
levadura, extracto de maíz triturado, sulfato
magnésico y fosfato dipotásico, y se incubó
en aerobiosis a 32ºC y agitación durante 38 h. En
cambio, en el trabajo de Shuai et al (2011) no se obtuvo
el concentrado bacteriano del suelo, sino de un macerado de
gambas, como ya hicieron en un estudio anterior (Shuai et
al, 2010); el medio de cultivo también difiere del
utilizado por los primeros investigadores (tiene sacarosa en
lugar de glucosa, triptona, y carece de levadura, el resto es
idéntico). La incubación se efectuó
igualmente en aerobiosis, pero a 37ºC y en agitación
sólo durante 16 h.

En ambos artículos se referenciaron una serie de
pasos para la purificación de la enzima y posterior
valoración proteica. En el de Wu et al (2006),
tras centrifugar el cultivo obtenido a 10,000 rpm durante 20 min
a 4ºC, se procedió a precipitar el sobrenadante
mediante la adición del mismo volumen de acetona durante
10 min a 0ºC. Posteriormente centrifugó durante 30
min a 4ºC a una velocidad de 8,000 rpm, disolviendo el nuevo
precipitado en una solución buffer Tris-ácido
clorhídrico con sulfato amónico, a pH 8. Lo que
quedó insoluble fue retirado tras otra
centrifugación. Mientras este primer trabajo separaba
claramente las etapas de purificación, el de Shuai et
al (2011) englobó todo el proceso en un punto del
apartado "Materiales y métodos". Las diferencias entre
este segundo trabajo y el de Wu et al (2006), en cuanto
a la primera fase de purificación enzimática,
estriban en detalles como la centrifugación del cultivo
(30 min, en lugar de 20 min) a la vez que utiliza una malla de
filtración de 0.45 µm, el nuevo producto lo
precipita también con sulfato amónico (al 60-80%) y
luego añade el buffer Tris-ácido
clorhídrico, tras centrifugar 20 min a 10,000 rpm.
Finalmente deja dializando el producto contra esta
solución buffer toda la noche a 4ºC, en vez de
centrifugar.

En la siguiente fase, ambos estudios purificaron el
extracto crudo enzimático con columnas de sepharosa: el
del año 2006 con CL4B-Sepharose pre-equilibradas con
buffer Tris-ácido clorhídrico y sulfato
amónico; el de 2011 utilizó DEAE-Sepharose con
buffer Tris-ácido clorhídrico suplementado con
cloruro sódico. El de Wu et al (2006)
procedió a lavar las columnas con el mismo buffer y
resuspendió las proteínas que habían quedado
unidas a la membrana de sepharosa con una solución
gradiente de sulfato amónico añadida al mencionado
buffer (Tris-ácido clorhídrico). El de Shuai et
al (2011) concentra las fracciones con GGT mediante una
centrifugación a alta velocidad en una membrana Amicon
PM-10 y luego resuspende el producto obtenido en una columna
Superdex 75 con buffer Tris-ácido clorhídrico, a
5ºC. Mediante el protocolo seguido por este segundo trabajo
se puede hallar la masa molecular de la enzima utilizando la
columna Superdex 75, que ha sido calibrada previamente con las
proteínas más frecuentes a modo de referencia
(albúmina sérica bovina -BSA-, ovoalbúmina,
ribonucleasa, aprotinina y vitamina B12). El azul dextrano,
inocuo, se une a las fracciones vacías de la columna a
modo de cemento para facilitar la reacción. Las fracciones
con actividad GGT fueron recogidas y analizadas mediante
electroforesis (SDS-PAGE) como recoge otro estudio previo
(Laemmli, 1970), con una especial modificación para la GGT
(Albert et al, 1961). En el trabajo de Wu et al
(2006), la fracción inicial obtenida en las columnas de
sepharosa se purificó mediante la técnica de
cromatografía de intercambio iónico en otra nueva
columna similar (DEAE-Sepharose), pre-equilibrada con el mismo
buffer Tris-ácido clorhídrico. Se efectúa un
primer lavado con el buffer para luego establecer un gradiente de
disolución con agua Milli-Q y el buffer (suplementado con
cloruro sódico) en cinco fases, es decir, en un principio
se añade exclusivamente agua Milli-Q, luego una
solución con un 80% de agua Milli-Q y un 20% del buffer, y
así hasta llegar, en fracciones del 20%, hasta el 100% del
buffer, en el que se resuspendió el producto con actividad
?-glutamil. El extracto purificado fue analizado igualmente con
electroforesis (SDS-PAGE), pero basándose en otro trabajo
anterior (Weber y Osborn, 1969).

En el trabajo primero (2006), para valorar la actividad
de la GGT, hace referencia a un estudio previo (Meister et
al, 1981), en el que se procede a incubar el producto
obtenido con buffer Tris-ácido clorhídrico,
?-glutamil-?-nitroanilida y glicilglicina, a 37ºC durante 30
min, parando la reacción tras añadir ácido
clorhídrico. La densidad óptica fue medida a 410 nm
y se definió una unidad de enzima como la cantidad de la
misma que liberaba 1 µmol/min de ?-nitroanilina de
?-glutamil-?-nitroanilida a través de la reacción
de transpeptidación. El segundo trabajo (2011),
reseña el artículo previo realizado por el mismo
grupo investigador donde también se explicaba el
método para determinar la actividad enzimática
(Shuai et al, 2010). La mezcla que se añade al
producto obtenido es muy similar a la que describe el trabajo de
Wu et al (2006), tiene ?-glutamil-?-nitroanilida,
glicilglicina, pero el buffer está compuesto por borato e
hidróxido sódico. También lo incuba a
37ºC durante 30 min y detiene la reacción con
ácido clorhídrico. La absorbancia y la
definición de la unidad enzimática las
evalúa de un modo idéntico al trabajo de Wu et
al (2006). En cuanto a la concentración proteica,
Shuai et al (2011) realiza el método de Lowry
(Lowry et al, 1951), mientras que Wu et al
(2006) hace lo propio con el método de Bradford, ambos con
el mismo estándar, la BSA (Bradford, 1976).

Los resultados obtenidos en ambos artículos, por
etapas y esquemáticamente, fueron:

Wu et al (2006)

Shuai et al (2011)

Protocolo de
purificación de la enzima GGT

1.- Organismo y muestras de partida: Bacillus
subtilis – muestreo efectuado en terrenos con
antecedentes de dicha bacteria.

2.- Medio de cultivo: medio RPMI suplementado con
L-Glutamina.

3.- Procedimiento de incubación: en
agitación (60 rpm) en atmósfera con oxígeno
(aerobiosis) a 37ºC durante 24 h.

4.- Centrifugación del cultivo obtenido a 10,000
rpm durante 30 min a 4ºC.

5.- Precipitación del sobrenadante con acetona
durante 10 min a 0ºC.

6.- Centrifugación a 8,000 rpm durante 30 min, a
temperatura de 4ºC.

7.- Adición de solución buffer 0.05 mol/l
de Tris-ácido clorhídrico suplementada con 1 mol/l
de sulfato amónico (70%), a pH 8. Dejar dializando toda la
noche a 4ºC frente al buffer con sulfato
amónico.

8.- Purificación del extracto crudo
enzimático con columnas de sepharosa (Hiprep
DEAE-Sepharose FF 16/10) con solución buffer 50 mM de
Tris-ácido clorhídrico + cloruro
sódico.

9.- Centrifugación a 15,000 rpm del producto
obtenido en membrana Amicon PM-10 y resuspensión en
columna Superdex 75 10/300 GL, con 50 mM Tris-ácido
clorhídrico.

10.- Recolección de las fracciones con actividad
GGT y análisis mediante electroforesis (SDS-PAGE) en gel
de acrilamida (12%) durante 50 min a 20 mA.

11.- Valoración de la actividad de la GGT, a
partir del producto con la fracción de GGT, al que se
añade 50 mmol/l de solución buffer
Tris-ácido clorhídrico (pH 8), 5 mmol/l de
?-glutamil-?-nitroanilida y 20 mmol/l de glicilglicina. Se deja
incubando a 37ºC durante 30 min, y se detiene la
reacción tras adicionar 0.1 mol/l de ácido
clorhídrico.

12.- Medición de la absorbancia mediante
espectrofotometría a 410 nm.

13.- Valoración de la concentración
proteica mediante el método de Bradford en una placa de
ELISA con 96 pocillos, tras realizar una curva patrón con
BSA diluida a diversas concentraciones (0, 20%, 40%, 60%, 80% y
100%) en buffer fosfato salino (PBS). Del mismo modo,
dilución del producto enzimático GGT en PBS a
concentraciones seriadas (20%, 60% y 100%). Tanto la curva
patrón como las muestras problema deben analizarse por
partida doble.

Aquí se ve un ejemplo:

14.- Medición de la densidad óptica
mediante espetrofotometría a 595 nm.

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Autor:

Isabel Mauriz Turrado

Facultad de Ciencias Biológicas y Ambientales.
Universidad de León.

Martha Gutiérrez Ordás

Escuela Universitaria de Trabajo Social. Universidad de
León.

José Manuel Martínez
Pérez

Departamento de Sanidad Animal. Instituto de
Ganadería de Montaña (León).