OBJETIVOS:
- Generar cambios genotípicos en bacterias
por medio de: - complementación funcional
- mutagénesis por
transposición - Transformar con un plásmido recombinante
células
competentes de E.coli
PROCEDIMIENTO:
Complementación funcional
Se realizó una complementación funcional
por conjugación triparental a una mutante pgm de
Agrobacterium tumefaciens, la cual carece de la enzima
fosfoglucomutasa. Al ser incapaz de transformar Glu-6-P en
Glu-1-P, no puede sintetizar polisacáridos estructurales
y de reserva que contengan glucosa. La
falta del exopolisacárido en estas mutantes se evidencia
al iluminar con UV placas conteniendo calcofluor,
observándose un fenotipo Dark.
En cambio, la
interacción del calcofluor con el EPS en
las cepas salvajes, muestra un
fenotipo Bright en presencia de UV.
Como bacteria donadora se utilizó un cultivo de
Escherichia coli CL4 el cual era resistente al
antibiótico Tetraciclina y contenía el
plásmido no conjugativo, movilizable, que llevaba la
secuencia completa del gen pgm de A. tumefaciens.
Como este plásmido carece de los genes tra,
necesarios para transferencia conjugativa, fue necesaria la
utilización de una cepa Helper 2013, la cual era
resistente al antibiótico Kanamicina. Este cultivo posee
los genes tra necesarios para la transferencia
conjugativa.
Con estas tres cepas se realizó un plaqueo en
medio LB sin antibióticos, reuniendolas en un mismo
inóculo para favorecer el evento de conjugación.
Se las incubó a 28 °C por una noche
(‘over-night’).
A modo de poder
seleccionar a las mutantes de pgm de A.
tumefaciens
que recibieron el plásmido con el gen
pgm, se utilizó un medio LB con los
antibióticos Kanamicina y Tetraciclina. Para poder
visualizar el fenotipo se utilizó calcofluor al
2%.
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