Transformación de Escherichia coli mediante diversas técnicas de biología molecular

2. Resumen
4. Objetivos
5. Materiales y
   métodos
6. Síntesis
   de la sonda radiactiva por PCR y
   purificación
7. Transferencia por
   la técnica de Southern Blot
8. Subclonado
9. Trasformación
   de bacterias con los productos de
   ligación
10. Purificación
    (MINIPREP) de DNA plasmídico. Inducción de la
    expresión génica y visualización de
    actividad
11. Identificación
    de clones positivos por restricción
12. Geles
    de proteínas e identificación de la
    proteína de fusión en geles nativos y
    desnaturalizantes
13. Resultados
14. Síntesis
    de la sonda radioactiva por el método de
    PCR
15. Purificación
    de los fragmentos de ADN, a partir del gel de
    agarosa
16. Purificación
    de ADN plasmídico, inducción de la
    expresión génica
17. Procesado de
    los cultivos inducidos y purificación de
    proteínas recombinantes utilizando glutation
    agarosa
18. Purificación
    de GFP e identificación de la proteína en geles
    nativos y desnaturalizantes
19. Conclusiones
20. Bibliografía

Resumen

Se realizó un subclonado del gen que codifica
para la `green fluorescent protein` (GFP) de de Aequorea
victoria en un vector de expresión procariota que
permite expresar la proteína recombinante con actividad
biológica. Se partió de un clon proveniente de una
biblioteca
genómica de A. victoria, se realizó un mapa
de restricción con enzimas de alta y
baja frecuencia de corte. Luego se realizó un
`southern-blot` con sondas sintetizadas por PCR para determinar
en que fragmentos de restricción se encontraba el gen que
codifica para la GFP. Se realizó el subclonado del gen que
cidifica para GFP, ligándolo en un vector de
expresión procariota. La digestión del vector y del
inserto se realizó con dos enzimas de restricción;
y ademas el vector fue fosfataseado para evitar el religado del
mismo, y además direccionar el inserto. El plásmido
de expresión utilizado fusiona el inserto a GST, lo que
puede utilizarse para facilitar la purificación. Luego de
transformar bacterias
(E. coli) se realizó una inducción de la expresión de la
proteína recombinante. Se purificó la misma
aprovechando el dominio GST y se
observó la actividad enzimática de la misma. Ademas
se realizaron geles nativos y desnaturalizantes para caracterizar
dicha proteína.

Introducción

inicialmente. Esto nos indica que la transmisión
horizontal no fue evidenciada. Puede que esto haya sido producto de la
baja densidad
poblacional utilizada en los experimentos
realizados (Smith y Contreras, 1998).

Objetivos

El objetivo de
este práctico es lograr la expresión de una
proteína recombinante con actividad biológica
(proteína verde fluorescente codificada por un gen de
Aequorea victoria) en Escherichia coli, utilizando
diversas técnicas
de biología
molecular.

Materiales y métodos

Digestión enzimática de un clon de
ADN

Se realizó una digestión enzimática
a partir de un clon de una biblioteca genómica que
poseía un inserto de 6kb clonado en el plásmido
pRibotex (3kb). Dentro del inserto se encontraba el gen completo
de la `green fluorescent protein` (GFP) de aproximadamente 700pb.
Con el fin de localizar la GFP dentro del inserto clonado, se
realizó un mapeo de restricción, diseñando
un protocolo de
digestión de DNA plasmídico con una serie de
enzimas de restricción de alta (Grupo 1) y
baja frecuencia de corte (los demás grupos). Estas
fueron seleccionadas adecuadamente de forma tal que incluyan las
mismas condiciones de reacción (buffer, temperatura,
pH de
reacción, etc.). Se utilizaron 5U de enzima de
restricción por cada g de ADN, con
seroalbúmina bovina (BSA), se incubaron a 37 grados
durante 2 horas a fin de evitar `star activity`. Las enzimas
empleadas se detallan en la tabla 1.

Tabla 1 – Enzimas de
Restricción utilizadas para la digestión
enzimática y el reastreo.