Técnicas de toma y preparación de la muestra. Homogenización y dilución. Método de Howard

Normas de
seguridad en el laboratorio

• 1. El acceso al laboratorio de
  prácticas sólo se permite a los alumnos que
  estén realizando las prácticas.

• 2. No se admiten visitas por
  razones de seguridad.

• 3. Los laboratorios de
  investigación son de acceso restringido al personal
  del Departamento.

• 4. Es obligatorio utilizar batas
  abrochadas siempre que se esté trabajando en el
  laboratorio. Durante el periodo de prácticas, la bata
  no debe utilizarse fuera del laboratorio.

• 5. Debe respetarse la
  prohibición de beber, comer, masticar chicle o fumar
  en el laboratorio y se debe evitar llevarse a la boca
  ningún objeto (bolígrafos…) o tocarse los
  ojos y nariz.

• 6. En la superficie de trabajo no
  deben depositarse en ningún momento ropa u objetos
  personales.

• 7. Cada alumno es responsable de
  la limpieza de su lugar de trabajo y del material asignado,
  así como de los microscopios que haya
  usado.

• 8. Se deben usar los mecheros
  Bunsen con precaución, no dejando material inflamable
  cerca y evitando el posible contacto con pelo y ropas. Se
  comprobará que se ha apagado el gas al finalizar el
  experimento y al abandonar el laboratorio.

• 9. Está prohibido pipetear
  con la boca.

• 10. Ante un vertido accidental de
  material microbiológico debe informarse inmediatamente
  al profesor encargado del grupo.

• 11. No se debe forzar un tubo de
  vidrio o la apertura de un frasco sin tener protegidas las
  manos.

• 12. No se manejarán los
  autoclaves o el material recién esterilizado si no se
  dispone de guantes apropiados.

• 13. La eliminación de
  residuos, material desechable y material reciclable se
  realizará siguiendo las instrucciones indicadas en el
  manual, utilizando los contenedores dispuestos a tal
  efecto.

• 14. Se deben lavar las manos con
  jabón antiséptico ante cualquier sospecha de
  contaminación y siempre antes de marcharse del
  laboratorio.

Introducción

En esta unidad de trabajo se tratan de un conjunto de
aspectos previos al análisis microbiológico en
sí. Nos referimos a las técnicas de
selección, toma y preparación de las muestras,
así como a su transporte y conservación. La
importancia de estas técnicas no debe ser subestimada,
pues un defecto en cualquiera de ellas puede invalidar los
resultados del análisis microbiológico.

Dentro del proceso analítico, la influencia del
muestreo es la más crucial, ya que de nada sirve un
análisis riguroso de la muestra, si esta no representa
para nada al sistema que se quiere medir. Por ejemplo, es obvio
que si se quiere analizar el contenido de un recipiente, se debe
de agitar el mismo antes de tomar la muestra, ya que de no
hacerlo, parte del contenido del mismo puede haber sedimentado.
Si lo que se busca se encuentra sobre todo en esa
fracción, el resultado del análisis, por preciso y
exacto que fuera, informará sobre una cantidad muy
inferior.

Además para el caso de la microbiología,
se da la circunstancia de que es relativamente fácil que
el proceso de muestreo contamine la muestra (si los recipientes,
utensilios no son estériles) aportándole
microorganismos que no estaban presentes. También puede
ocurrir que el proceso de muestreo favorezca el crecimiento de un
microorganismo frente a otros.

Por ejemplo, para realizar un recuento de bacterias en
el agua corriente hay que dejar el grifo abierto durante un
tiempo largo antes de tomar la muestra. Si se toma la muestra
nada más abrir el grifo y este lleva varios días
sin abrirse, el agua del último tramo de
cañería llevará estancada allí el
tiempo suficiente para que pueda haber habido crecimiento
bacteriano. Por lo tanto, la muestra contendrá muchas
más bacterias que el agua corriente de la red general y
los resultados del análisis no serán ciertos para
el agua corriente.

Muestreo

2.1. Definición de muestreo.

Cuando se pretende conocer el estado
microbiológico de un sistema, como alimentos envasados en
porciones individuales (botellas de leche, latas de conserva,
tripas de embutidos, etc.), no envasados (como canales de
carnes), sistemas naturales (como un río, un lago), etc.
solo se puede analizar una pequeña parte del mismo. Esta
fracción del sistema, que se denomina muestra, debe
representar plenamente las propiedades a estudio del sistema. El
muestreo consiste en tomar esa fracción del sistema, de
manera que la muestra recogida sea representativa.

En el caso de alimentos envasados, el muestreo consiste
en tomar un pequeño número de muestras de cada lote
o remesa, elegidas de modo que estas muestras sean
representativas del total. El muestreo se basa en la
suposición de que todas las muestras del mismo lote son
similares por haber sufrido un trato igual. Sin embargo, hay
quetener presente que a veces una unidad estropeada puede escapar
al muestreo, aunque esto sucede sólo en muy pocos casos.
En el caso de alimentos no envasados, consistirá en tomar
un porción de una manera aséptica y en el caso de
aguas, tomar un volumen determinado, también de forma
aséptica.

2.2. Condiciones que deben cumplirse en la toma de
muestras.

Las condiciones que se deben cumplir para realizar una
toma de muestras adecuada son:

• a. El operador debe poseer unos conocimientos
  microbiológicos generales y usar estos conocimientos
  aplicando el sentido común

• b. Se deben conocer las características
  físico-químicas y microbiológicas del
  material que se va a analizar.

• c. La muestra debe ser representativa del
  alimento que se analiza. Para ello es necesario realizar el
  muestreo con el procedimiento adecuado para cada
  caso.

• d. La cantidad de muestra tomada debe ser
  suficiente para realizar todo el proceso analítico. Es
  conveniente tomar al menos el doble de la cantidad
  mínima para tener una reserva de muestra en
  previsión de algún error que pueda obligar a
  repetir el análisis.

• e. Las operaciones de toma de muestra deben
  preservar la identidad de la misma. Esto significa que deben
  evitarse contaminaciones de la muestra, lo que obliga a
  trabajar con instrumentos y recipientes estériles. Si
  por descuido del operador se produce

• f. contaminación de una muestra con los
  resto de otra se dice que es una contaminación
  cruzada.

Técnicas
de toma de muestra

3.1 Toma de muestras de alimentos
envasados

Cuando se va a hacer un muestreo de alimentos envasados
de modo individual, las muestras pueden ser elegidas de manera
aleatoria para ser representativas. Esto se consigue con
métodos tales como el empleo de la tabla de números
al azar. Este método consiste en separar del lote un
número de muestras calculado previamente, utilizando la
tabla de números al azar. Dicha tabla está
integrada por columnas y filas de dígitos obtenidos
mediante cálculos estadísticos.

Una vez establecido el número de muestras que se
deben tomar del lote, se numeran ordenadamente cada uno de los
paquetes, contenedores o unidades del producto por muestrear. Si,
por ejemplo, el lote está integrado por 200 unidades, su
numeración se marcará del 1 al 200,
correlativamente. Con un lápiz se señala un lugar
cualquiera en la tabla de números al azar, coincidiendo
con un dígito o su proximidad. Este dígito sirve de
punto de partida para la separación del número de
muestras destinadas al análisis.

Supongamos que se ha punteado con el lápiz un
lugar que corresponde a la fila 15 y a la columna 10. Este
número es el 1 y los que le siguen en las columnas 11 y 12
son el 4 y el 6. En este caso, la unidad que se tiene que separar
del lote es la marcada con el número 146. A
continuación se pasa a la fila 16 y a las mismas columnas
10, 11 y 12, a las que corresponde el número 078, una
nueva unidad que se separa del lote. Pasando a la fila 17,
columnas 10, 11 y 12, figura el número 152, que
será también separado del lote. Se procede de la
misma forma hasta obtener el número de muestras
señalado previamente.

3.2 Toma de muestras de productos a granel
sólidos

Cuando se trata de muestrear productos a granel, si se
trata de sólidos lo que se hace es tomar varias muestras
en partes diferentes del material sólido que estén
alejadas entre sí. Deben tomarse muestras tanto con zonas
aireadas del sólido como con material profundo. En los
alimentos constituidos por componentes diferentes hay que
asegurarse de que la proporción de cada componente en la
muestra tomada es similar a la original.

3.3 Toma de muestras de productos a granel
líquidos

En los productos a granel líquidos basta con
mezclar bien y tomar una muestra del líquido bien
homogeneizado. Si el producto por muestrear tiene salida por un
conducto, se desechan las primeras porciones antes de tomar la
muestra. Si la toma es de agua de un grifo, se desinfecta
éste con alcohol. Luego se abre y se desecha el agua que
sale en las primeras porciones. Se cierra de nuevo el grifo y se
flamea la gota que queda pendiente hasta que emita vapores. A
continuación se vuelve a abrir el grifo, dejando fluir el
agua durante 1-2 minutos antes de recogerla en el recipiente
estéril de la toma de muestras. Este será cerrado
convenientemente en condiciones asépticas.

3.4 Toma de muestras de productos
sólidos

Para productos sólidos (queso, jamón
serrano o cocido, y similares) se tomarán las muestras en
varias zonas con cuchillos, taladros, sierras, etc.,
estériles. Las muestras se introducirán,
asépticamente, en recipientes estériles.

3.5 Toma de muestras de aguas

Las muestras serán recogidas en un recipiente
estéril en un punto de muestreo representativo. Proceder
como en 3.3.

3.6 Concepto de muestra única

En ocasiones, las muestras que se deben recoger son
únicas, circunstancia frecuente cuando se trata de
alimentos sospechosos de toxiinfección alimentaria. Las
muestras únicas en muchos casos son irreemplazables y
entonces hay que tratarlas con un cuidado especial porque su
pérdida o deterioro puede suponer un problema
serio.

3.6 Útiles empleados en la toma de
muestras

En la toma de muestras de alimentos se utilizan
útiles de diversos tipos:

• Frascos de boca ancha y bolsas de plástico
  estériles.

• Instrumentos esterilizados para abrir envases:
  tijeras, cuchillos, abrelatas, sondas, etc.

• Sacabocados estéril: para uso en alimentos
  sólidos.

• Etiquetas, rotuladores y
  bolígrafos.

• Líquido desinfectante: etanol
  70°.

• Termómetro.

3.7. Identificación de las
muestras.

Las muestras recién tomadas deben ser
identificadas adecuadamente y de modo inmediato. En muestras de
alimentos se anotará el tipo de muestra, la fecha, el
número de lote, el lugar de procedencia y otros datos que
puedan ser interesantes en cada caso: temperatura de
almacenamiento del alimento, método de muestreo,
precauciones para el transporte de la muestra, etc.. Estos datos
se anotarán en etiquetas adhesivas que no puedan
despegarse o rotuladas sobre el envase de modo que no pueda
borrarse accidentalmente. Además, las anotaciones deben
ser perfectamente legibles sin que haya posibilidad de
confusión.

Transporte y
conservación de las muestras

El adecuado transporte y conservación de las
muestras se consigue cumpliendo una serie de
requisitos:

• a. El espacio de tiempo transcurrido entre la
  toma de muestra y el comienzo del análisis en el
  laboratorio debe ser lo más corto posible.

• b. Toda muestra debe estar correctamente
  identificada.

• c. Deben seguirse todas las precauciones
  necesarias para preservar la representatividad de la muestra.
  Esto significa que:

• deben evitarse contaminaciones de las muestras
  durante su transporte y almacenamiento;

• deben evitarse sobrecrecimientos de microorganismos;
  esto es especialmente importante.

• en aquellas muestras destinadas a realizar recuentos
  de gérmenes (orina, agua, leche, etc.). La
  refrigeración es un método útil, pero
  sólo por tiempo limitado.

• d. Deben conocerse las características
  de la muestra para evitar su transporte y conservación
  inadecuados.

• e. Los envases utilizados y su
  manipulación deben evitar derrames que pueden llegar a
  ser muy peligrosos. Los recipientes deben, por tanto, ser
  herméticos y mecánicamente resistentes. Debe
  evitarse cuando sea posible el empleo de envases de
  vidrio.

Preparación de muestras para su
análisis

5.1 Introducción

Hay muestras que pueden ser cultivadas o sometidas a
pruebas de identificación tal y como se reciben en el
laboratorio. Sin embargo, muchas otras deben ser preparadas
(modificadas) antes del análisis microbiológico.
Esto sucede cuando se presenta una de estas
situaciones:

• a. La muestra es sólida o pastosa y se
  hace necesario licuarla.

• b. La muestra contiene una elevada carga de
  bacterias y hay que diluirla.

A continuación estudiaremos las técnicas
utilizadas en cada una de estas situaciones, pero antes tenemos
que advertir que en las operaciones de preparación de
muestras hay que guardar todas las reglas de asepsia que permitan
evitar la contaminación de la muestra.

5.2 Muestras sólidas o pastosas que es
necesario licuar.

En el análisis microbiológico de alimentos
sólidos o de elevada viscosidad es necesario transformar
la muestra en una suspensión líquida que contenga
los microorganismos repartidos de forma
homogénea.

Esto se consigue agregando un volumen medido de
diluyente estéril a una cantidad pesada de muestra
sólida y utilizando después algún
procedimiento de trituración y
homogeneización.

Procedimiento.

1 Separación de la muestra
analítica.

Llamamos muestra analítica a la porción de
la muestra total (la cantidad llevada al laboratorio) que va a
ser usada en el análisis. El resto de la muestra,
utilizada como reserva, no es muestra
analítica.

La cantidad de muestra analítica tomada para
homogeneizarla debe ser suficientemente grande como para que sea
representativa, como ya se mencionó antes. En algunas
situaciones la cantidad de muestra a homogeneizar está
establecida por la legislación sanitaria. Cuando el
alimento está formado por distintos componentes (por
ejemplo: una lata de cocido que contiene garbanzos, caldo y
trozos de carne), la muestra analítica debe contener todos
los componentes de la muestra completa y además mantener
las mismas proporciones.

2 Pesada de la muestra.

Se hará en condiciones asépticas. Puede
operarse de dos formas:

a) Se pesa la cantidad exacta de muestra y
después se agrega un volumen previamente medido de
diluyente.

b) Cuando resulta difícil pesar una cantidad
exacta de muestra, se pesa una cantidad aproximada y
después se mide el diluyente necesario en una probeta
estéril.

3 Diluyente.

La principal característica que debe tener un
diluyente es no producir modificaciones cualitativas ni
cuantitativas en la flora de la muestra, es decir, debe mantener
lo más fielmente posible la flora de la muestra sin
suprimirla ni favorecer su desarrollo. En microbiología
alimentaria se utilizan varios diluyentes.

Entre los más usados se encuentran:

• Agua de Triptona con NACL

• Disolución de Ringer 1/4

• Agua de Peptona Tamponada.

• Solución Reguladora de Fosfatos.

El mismo diluyente empleado en preparar la
suspensión madre es el empleado en preparar la serie de
diluciones decimales.

4. Homogeneización de la
muestra.

En la homogenización hay que evitar la
destrucción de los gérmenes por rotura de su
membrana o por calentamiento excesivo. Además de la
perfecta trituración de la muestra es necesario obtener
una mezcla homogénea que tenga una distribución
uniforme de los gérmenes y de sus toxinas. Hay varios
tipos de homogenizadores y dentro de cada tipo puede haberlos de
capacidades diversas:

• a. Homogeneizadores de jarra: consisten en un
  vaso de vidrio o acero con una hélice en su base que
  funciona cuando se acopla a un motor.

• b. Homogeneizadores de vástago con
  hélice: el vástago se introduce en un vaso con
  la mezcla que se va homogeneizar. Funciona como una batidora
  clásica de cocina.

Estos dos tipos de homogeneizadores tienen el
inconveniente de que necesitan una limpieza exhaustiva y una
esterilización antes de cada homogeneización. Esto
supone un engorro. Otro inconveniente es que producen aerosoles
que pueden contener microorganismos patógenos.
Además, por el tipo de homogenización tan agresiva
que realizan, pueden destruir los microorganismos que queremos
estudiar. Los inconvenientes de estos homogeneizadores no
están presentes en los:

• c. Homogeneizadores de paletas: la mezcla de
  muestra y diluyente se introduce en una bolsa de
  plástico estéril. Esta bolsa se sitúa en
  el homogenizador, que está provisto de paletas que
  golpean rítmicamente la bolsa. Esto dilacera
  (desmenuza) el alimento y pone los gérmenes en
  suspensión. Para homogeneizar una nueva muestra no hay
  que limpiar nada: se utiliza una nueva bolsa. Modelos
  comerciales conocidos son: Stomacher y Masticator.

En la homogeneización de alimentos sólidos
es frecuente que la suspensión se prepare al 10 %
peso/volumen. De este modo, la cantidad de alimento pesada
expresada en gramos se multiplica por 9 y el número
obtenido es el volumen en centímetros cúbicos de
diluyente a agregar. A la suspensión obtenida se le llama
suspensión madre, dilución 1/10 o dilución
-1, porque: 1/10 = 10-1

Las muestras de alimentos líquidos no es
necesario licuarlas, pero puede ser necesario
homogeneizarlas.Esto puede conseguirse simplemente agitando bien
el envase antes de abrirlo.

5.3. Muestras con una elevada carga
bacteriana.

Las muestras con una carga bacteriana elevada no deben
cultivarse directamente, pues las colonias de bacterias
crecerían demasiado juntas. Es necesario entonces diluir
la muestra. El procedimiento de dilución depende de los
fines perseguidos.

Diluciones decimales seriadas.

Se hacen para realizar recuentos microbianos. Una serie
de diluciones decimales suele prepararse así:

1. La muestra se homogeneiza al 10 % (p/v),
obteniéndose la dilución -1.

2. A un tubo que contenga 9 cc de diluyente
estéril se le agrega 1 cc de la dilución -1. Tras
mezclar muy bien se obtiene la dilución -2
(1/100).

3. Puede obtenerse la dilución -3 agregando 1 cc
de la dilución -2 a un tubo de ensayo que contenga 9 cc de
diluyente y mezclando bien después.

4. Las diluciones sucesivas que sean necesarias (-4, -5,
-6, etc.) se preparan de modo similar. Para preparar cada una de
las diluciones debe utilizarse una pipeta limpia y
estéril. La serie decimal así preparada debe
inocularse en el medio de cultivo de inmediato o, como
máximo, dos horas después de haberla preparado.
Siempre que su uso se retrase más de 10 minutos deben
refrigerarse los tubos. De no respetar estas limitaciones
probablemente haya crecimiento bacteriano que invalide las
diluciones preparadas.

Referencias
Bibliográficas

Norma Oficial Mexicana Nom-110-SSA1-1994,
Bienes y Servicios. Preparación y dilución de
muestras de alimentos para su análisis
microbiológico.

Método de
Howard

Objetivo

Enumerar fragmentos de micelio en muestras
de alimentos como purés, jugos, salsas.

Fundamento

El método de Howard se utiliza mucho
en la industria para el conteo de filamentos de mohos en ciertos
productos como el jugo de tomate. Es un método
rápido, casi no se gastan reactivos y es relativamente
sencillo de practicarse, solo se requiere de mucha experiencia
para obtener resultados confiables.

Se recomienda estudiar el producto bajo el
microscopio antes de contar mohos para familiarizarse con la
apariencia del alimento. El puré de tomate puede usarse
sin diluir para cuentas de rutina. Se diluye cuando los limites
son superiores a un 40 %.

En el caso de cítricos centrifugar
50 ml de jugo por 10 minutos a 2200 r.p.m. decantar,
añadir 5 ml de pectina u otro agente engrosante y
mezclar.

Procedimiento de conteo.

En un portaobjetos se coloca la
muestra

Se examina con el microscopio. La cantidad
de muestra debe ser de 0.1 ml y debe ocupar un área de 1
cm2. Se cuentan 25 campos en un portaobjetos y 25 en otro. Se
comienza en un extremo y se recorre el portaobjetos hasta el otro
lado. Un campo es positivo si la longitud del filamento del moho
excede en 1/6 del diámetro del campo.

La cuenta de mohos por el método de
Howard es el porcentaje de campos positivos en 2 laminillas con
la muestra. La cuenta de un solo portaobjetos no es muy
significativa.

Identificación de cuentas de
mohos

Su identificación se aprende por
experiencia. Si se tiene duda sobre una estructura, no la cuente.
Los filamentos de mohos tienen las siguientes
características:

• Estructura tubular gruesa.

• Paredes dobles paralelas de apariencia
  similar.

• Material interior granulado y a menudo
  separado en segmentos.

• Hifas claras.

Cuestionario

1. -Analice las siguientes muestras: salsa
catsup, puré de tomate, puré de un tomate sano,
puré de un tomate podrido, infestado de hongos.

2. -Reporte sus resultados en porcentajes,
indique si están dentro de los limites o los
rebasan.

3. -Indique cuales son los límites
para salsa catsup, puré de tomate, salsas y
sopas.

4.- ¿ En qué casos nos puede
servir como indicador, el método de Howard?.
¿Qué otro tipo de indicadores deben complementar la
información?. Elabore un mapa conceptual.

5.- Explique el método de
Howard.

Autor:

Mireya XXX