’Comportamiento de la resistencia a meticilina de cepas de Staphylococcus aureus (página 3)

Hemocultivo: Muestra de sangre tomada por punción
venosa, teniendo en cuenta que la proporción entre el
volumen de sangre obtenida y el volumen de caldo de cultivo debe
estar en una relación de 1:5 – 1:10 (57).

El hemocultivo o cultivo microbiológico de la
sangre constituye en los casos de septicemia, el único
examen que permite su confirmación.

Toma de muestra para hemocultivo

Material Necesario

· Frascos de hemocultivo.

· Compresas de goma.

· Jeringas y agujas de punción
IV.

· Gasas estériles.

· Guantes de goma estériles.

· Alcohol etílico o isopropílico al
70%.

· Solución Yodada.

Obtención de la Muestra

– La muestra debe obtenerse por punción
periférica (venosa o arterial), siempre por una nueva
punción y debe ser la primera muestra que debe obtenerse
si existe indicación de otros exámenes.

El procedimiento de extracción de sangre para la
realización de hemocultivos se debe realizar cumpliendo
las máximas precauciones de asepsia.

– Lavarse las manos.

-Colocar ligadura y campo estéril.

-Palpar la vena a puncionar.

– Realizar antisepsia con alcohol 70% en una zona de
piel de unos 10cm de diámetro alrededor del sitio de
punción. Se comenzará por el centro y se
irán haciendo círculos concéntricos hacia el
exterior.

-Repetir el procedimiento utilizando Yodo povidona al
10%.

-Dejar actuar 1-2 minutos, esto es hasta que se seque el
antiséptico sobre la piel.

– Mientras actúa el iodóforo, retirar los
tapones externos de los frascos, desinfectar el tapón de
goma del frasco de hemocultivo con alcohol 70% y dejar secar al
menos un minuto.

-Colocarse los guantes estériles.

-Extraer la sangre sin tocar en ningún momento el
campo desinfectado. Si fuera necesario palpar nuevamente la vena
se cambiará los guantes estériles y se
realizará nueva antisepsia de piel.

– Inyectar directamente la sangre en el frasco. No es
necesario cambiar de aguja.

– Mover los frascos para que la sangre y el medio de
cultivo se mezclen.

-Debe utilizarse una vena distinta para cada
extracción.

Volumen de la Muestra

La cantidad de sangre a introducir en cada frasco viene
determinada por el modelo utilizado en cada hospital, como norma
general es adecuado que la sangre mantenga una proporción
1:10 con el medio de cultivo. En caso de neonatos y niños
pequeños en que no se pueden obtener volúmenes
grandes de sangre es suficiente una cantidad de 1-5 ml, que se
introduce en un solo frasco.

En este centro hospitalario se tiene normado 10ml para
100ml de medio de cultivo (Infusión cerebro
corazón) en los adultos y 2ml de sangre para 20ml de medio
de cultivo en los neonatos.

Número de Muestras

Tres hemocultivos por paciente, previos al tratamiento
antimicrobiano. El intervalo entre las extracciones debe ser
superior a una hora cuando sea posible, pero cuando exista una
gran urgencia en iniciar el tratamiento, este intervalo puede
acortarse hasta 15 minutos. En caso de sepsis y endocarditis
subaguda las extracciones se reparten en 24 horas y en caso de
que sean los hemocultivos negativos, obtener tres muestras
más al día siguiente. Las muestras se procesaron
independientemente el número de ellas por paciente en la
investigación.

Transporte

Deben enviarse al laboratorio. Hasta su envío
mantener a 35-37ºC; cuando esto no sea posible, mantener a
temperatura ambiente. Nunca debe refrigerarse ni
congelarse.

Anexo 3

Medios de cultivos y reactivos utilizados para la
realización de los procederes
técnicos.

Medios de transporte de Stuart- Amies

Se emplean para favorecer y conservar la viabilidad de
los microorganismos mientras son transportados al
laboratorio.

Fundamento

Se trata de medios no nutritivos, semisólidos y
reductores que previenen la destrucción de los
gérmenes y los mantienen en estado estacionario. Su
composición salina permite conservar la muestra hasta su
entrega al laboratorio.

En la formulación del medio de Transporte Stuart,
hay Azul de Metileno que actúa como indicador de la
oxidación del medio, cuando la mitad del medio contenido
en un tubo presenta color azulado, el medio no está en las
condiciones adecuadas de transporte. Para restablecer la
anaerobiosis debe licuarse, de nuevo el medio.

El medio de transporte Stuart se puede suplementar con
Ácido rosólico a razón de 10ml de
Ácido rosólico al 10% por litro de
medio.

Preparación

Disolver 13 g del Medio de Transporte Amies sin
Carbón, 13,2 del Medio de Transporte Cary-Blair, ó
14,1 del Medio de Transporte Stuart en 1l de agua destilada.
Distribuir en tubos o viales con tapón de rosca
llenándolos casi por completo y esterilizar en autoclave
(121° C de 10-15 minutos). Dejar enfriar y solidificar en
posición vertical. Reapretar los tapones, si fuese
necesario, cuando el medio este frío.

El Medio de Transporte Stuart es el que presenta menor
concentración de agente gelificante, para el transporte es
aconsejable añadir 7g de Agar por litro de medio, antes de
su esterilización.

Modo de empleo

La recogida del material se hace con un
hisopo de algodón esterilizado. Este hisopo se introduce
en el tubo que contiene el medio de transporte, se cierra
herméticamente y se conserva en frío hasta su
transporte.

Base de agar sangre: medio de propósito
general para el cultivo de una gran variedad de microorganismos,
incluyendo los exigentes, al añadirle sangre puede
utilizarse para la determinación de las reacciones
hemolíticas

Preparación: suspender 40 g en 1L de agua
destilada o desionizada, hervir hasta disolución completa,
esterilizar a 121ºC por 15 min. Enfriar hasta 45-50 ºC,
añadir asépticamente de 5 a 10 % de sangre
estéril desfibrinada a temperatura ambiente, mezclar y
distribuir.

Medio de cultivo de agar Mueller
Hinton.

Preparación: suspender 38 g en 1 L de agua
destilada o desionizada, hervir hasta disolución completa,
esterilizar a 121 ºC por 15 min y distribuir.

Hidrógeno Peróxido 6% p/v (20 vol.)
estabilizado (BP)

Se utiliza como reactivo para la prueba de la Catalasa.
La catalasa es una enzima propia de la mayoría de las
bacterias aerobias y anaerobias facultativas que poseen
citocromos, con la excepción de Estreptococos.

Su función es descomponer el Peróxido de
Hidrógeno (H2O2) desprendiendo oxígeno
libre.

Anexo 4

Métodos de
Diagnóstico Microbiológico

Para el aislamiento primario de las muestras
purulentas se utilizaron los métodos convencionales
de diagnóstico disponibles como siembra por agotamiento
por estrías, utilizando asa de platino, en placas de agar
sangre, se incubaron a temperatura óptima de crecimiento
de 37º C por 18-24 horas, concluido este periodo se
realizó su lectura.

Las muestras de sangre para hemocultivo en el
frasco recomendado para el proceder se incubaron a 37º C en
aerobiosis por un período de 7 días, con
observación diaria del aspecto macroscópico en
busca de signos que indicaran desarrollo bacteriano:
hemólisis, turbidez, presencia de gas, colonias. Cuando
aparecieron estos signos se realizó tinción de Gram
directa homogeneizando el contenido del frasco de hemocultivo por
agitación suave, colocando una gota en el extremo del
porta objeto y extendiendo con un cubre objeto en ángulo
45º.

Se subcultivó a una placa de agar Mac Conkey y a
una de agar sangre, con lectura de las mismas a las 18-24 horas
de incubación a 37º C .

Se realizaron subcultivos a ciegas en iguales medios de
cultivo aunque no se observaran evidencias de desarrollo e
independientemente del aspecto macroscópico que presentara
la botella a las 24 horas, 72 horas y al 7º día de
incubación.

Para ambas muestras la lectura se realizó
teniendo en cuenta las características
macroscópicas culturales.

Morfología colonial: las muestras se
estrían sobre placas de cultivo y las colonias aisladas de
las bacterias las cuales se observan a simple vista aparecen
después de uno a varios días de incubación,
la observación de las colonias se caracteriza por su
tamaño, la textura, el color y (si ha crecido en agar
sangre) las reacciones de hemólisis. La morfología
colonial es altamente importante como un primer paso en la
identificación bacteriana. En caso de que el organismo
requiera oxígeno para el crecimiento, esta otra
característica es relevante en la diferenciación.
De manera general los integrantes del género
Staphylococcus proliferan fácilmente en la mayor
parte de los medios de cultivos bacteriológicos en
condiciones aeróbicas o microaerofílicas. Las
colonias en medios sólidos son redondas, lisas, elevadas y
resplandecientes (brillantes) que van desde un color gris a
amarillo dorado intenso, tornándose traslúcidas a
casi trasparentes con una incubación prolongada. Los
pigmentos, cuya producción es regulada por enzimas
termoestables, se desarrollan mejor a una temperatura de 20-250C
y no se producen de manera anaerobia o en medios de cultivo
líquidos. Muchas colonias sólo los producen
después de un largo período de
incubación.

Tinción de Gram: coloración
diferencial para identificación diagnóstica de
bacterias. Procedimiento técnico:

Un toque del asa sobre la colonia bacteriana se debe
disolver sobre una gota de agua y extender como una capa fina
sobre un portaobjetos. Se deja secar la preparación, se
fija al calor suave y se trata como sigue:

Paso 1. Tinción con cristal violeta.

Paso 2. Fijación con una solución de yodo.
Estabiliza el cristal violeta, todas las bacterias en la
preparación permanecen de color púrpura o
azul.

Paso 3. Extracción con alcohol u otro solvente.
Decolora algunas bacterias (las gramnegativas) y no otras (las
grampositivas).

Paso 4. Tinción de contraste con safranina. Las
bacterias grampositivas ya están teñidas con
cristal violeta y permanecen de color púrpura. Las
bacterias gramnegativas se tiñen de color rosa.

A continuación la apariencia de las bacterias se
observa bajo el microscopio. Las preguntas que se deben hacer
incluyen:

• ¿Se trata de bacterias grampositivas o
  gramnegativas?

• ¿Cuál es la morfología
  (bastones, cocos, espirales, pleomórficas [forma
  variable], etc.)?

• ¿Aparecen las células en forma
  separada o formando cadenas, racimos, pares, etc.?

• ¿De que tamaño son las
  células?

Se observan cocos Gram positivos o gramvariables con
diámetros que van desde 0,5 hasta casi 1,5 &µg.
Los MO pueden aparecer aislados, en parejas, cadenas cortas o en
racimos, tanto dentro como fuera de los leucocitos
polimorfonucleares (PMN). Las variaciones en el tamaño
celular y en ña tinción de gran se deben
probablemente a la acción de las células
inflamatorias y a sus enzimas hidrolíticas en las
células bacterianas. En los frotis directos, los pares o
cadenas cortas de MO no pueden diferenciarse de estreptococos,
micrococos o peptoestreptococos, aunque los estreptococos suelen
aparecer como cadenas o diplococos más que como cadenas de
células individuales aisladas. No permite distinguir los
microorganismos saprófitos de los
patógenos.

Prueba de la coagulasa: probar la capacidad de un
microorganismo de coagular el plasma por la acción de la
enzima coagulasa (estafilocoagulasa). Se utiliza de manera
específica para diferenciar especies dentro del
género Staphylococcus.

Plasma fresco de sangre entera

Extraer asépticamente 10 ml de sangre
heparinizada o con EDTA de: animal (cordero, conejo o caballo) o
humano.

Centrifugar o esperar a que los glóbulos rojos se
sedimenten

Separar asépticamente el plasma

Nota: puede diluirse 1: 4 o utilizarse puro

Distribuir en tubos de ensayo, de acuerdo a las
necesidades

Almacenar a 4 grados

Procedimiento técnico

Prueba de coagulasa en tubo: tubo de vidrio (13 x 100
mm) agregar 0.5 ml de plasma fresco de sangre entera, ya probado
sin diluir.

• agregar 0.5 ml de un cultivo puro en caldo de 18 a
  24 h de Staphylococcus o una gran ansada de una colonia pura
  de una placa de una placa de agar.

• rotar el tubo suavemente para lograr la
  suspensión de las bacterias. No sacudir.

• incubar a 37 ºC ,4 h, observar c/30 min para la
  coagulación no sacudir ni agitar el tubo al observar,
  inclinar suavemente para visualizar si existe
  coágulo.

La coagulasa en tubo esta indicada por la presencia de
un coágulo parcial (coágulo libre suspendido en
plasma) o de un coágulo completo (sólido que no se
mueve cuando se invierte el tubo). Un precipitado
flocúlento o fibroso o con ambas características no
es un verdadero coágulo y debe registrarse como resultado
negativo.

Se recomienda utilizar una graduación de la
coagulación: coágulo 3+ ó 4+, concluyente,
2+ o menos no concluyente. Se considera solo reacción
positiva la concluyente. Cuando en grado de coagulación no
es concluyente, es necesario realizar otras pruebas, como
fermentación del manitol y termonucleasa, mas la
última. Algunas cepas de Staphylococcus pueden
ser + a las 2-4 horas y luego revertir. Un resultado en tubo que
muestre se negativo después de 4 horas a 35ºC debe
ser mantenido a temperatura ambiente (22-25ºC) y
leído de nuevo a las 18-24h, debido a que algunas cepas
producen fibrinolisina con la incubación prolongada a
35ºC, lo cual provoca la disolución del
coágulo. Los estudios sugieren que una temperatura
más alta inhibe la producción de la enzima en vez
de afectar la actividad enzimática.

Prueba de la catalasa (catalasa
positivos)

Los estafilococos y los micrococos se diferencian de los
estreptococos, enterococos y bacterias tipo-estreptococos, por el
test de catalasa. La catalasa es una enzima que descompone el
peróxido de hidrógeno (H2O2) en oxígeno y
agua. Desde el punto de vista químico, es una
hemoproteína similar en estructura a la hemoglobina,
excepto en que los cuatro átomos de hierro en la
molécula están en la forma oxidada en lugar de
reducida. Salvo los estreptococos, la mayor parte de las
bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad
catalasa. La mayoría de las bacterias anaerobias que
descomponen el H2O2 lo hacen mediante enzimas peroxidasas, en
forma semejante a la catalasa, excepto que cada molécula
contiene un solo ion férrico. El peróxido de
hidrógeno es uno de los productos oxidativos finales en el
metabolismo aerobio de los CHO. Se se acumula, es letal para las
células bacterianas. La catalasa convierte el
peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. La
prueba de la catalasa, realizada por los métodos del
portaobjetos o en tubo, por lo común se emplea para
diferenciar los estreptococos (negativo) de los estafilococos
(positivo), o para diferenciar bacilos grampositivos de las
micobacterias.

Prueba en portaobjeto

Se transfieren células desde el centro de una
colonia bien aislada a la superficie de un portaobjeto de vidrio
con una aguja de inoculación o un aplicador. Se agrega una
o dos gotas de solución de peróxido de
hidrógeno al 3% sobre el portaobjetos. Se recomienda que
el MO no sea agregado al reactivo (revirtiendo el orden), en
especial si se utilizaron agujas de inoculación o asas con
contenido de hierro, porque puede haber resultados
falsos-positivos.

Método en tubo o placa de agar

Agregar unas pocas gotas (alrededor de 1ml) de reactivo
e peróxido de hidrógeno al 3% directamente sobre la
superficie de agar en placa o en pico de flauta.
Interpretación: La rápida aparición y
sostenida de burbujas de gas o efervescencia indica una prueba
positiva (conversión del H2O2, en agua y oxígeno
gaseoso). Como algunas bacterias pueden tener otras enzimas que
descompongan el peróxido de hidrógeno, la
producción de unas pocas burbujas pequeñas formadas
después de 20-30 segundos no se considera un resultado
positivo. En forma ideal, la prueba de la catalasa debe
realizarse a partir de un medio que no contenga sangre, porque
los hematíes por sí mismos pueden causar una
reacción de catalasa débil positiva. Sin embargo,
como la mayoría de los laboratorios clínicos
recuperan estafilococos de medios no selectivos o de medios
selectivos que contienen sangre (agar sangre y agar CNA,
respectivamente) se debe tener el cuidado de tomar la muestra
sólo de la parte superior de las colonias para la prueba
de la catalasa a fin de evitar el traslado de sangre y las
posibles reacciones falsa positivas. Las cepas raras de
estafilococos pueden ser catalasa negativas y algunos enterococos
producen una seudocatalasa y son débilmente reactivos con
H2O2.

Patrón de turbidez: estándar de
turbidez de 0.5 de McFarland.

Anexo 5

Pruebas de susceptibilidad a los
antimicrobianos

Susceptibilidad por el método de Kirby-Bauer: El
antibiograma disco-placa basado en el trabajo de Bauer, Kirby y
col. es uno de los métodos que el Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI) recomienda para la
determinación de la sensibilidad bacteriana a los
antimicrobianos. La lectura de los halos de inhibición
debe interpretarse como sensible (S), intermedia (I) o resistente
(R) según las categorías establecidas por el CLSI.
Las instrucciones para el cumplimiento de esta técnica
están descritas en documentos periódicamente
disponibles del CLSI.

Categorías de
interpretación

Sensible: significa que el microorganismo
causante del proceso infeccioso debe responder exitosamente al
tratamiento con ese antibiótico a dosis habitualmente
recomendadas y por una vía apropiada.

Resistente: significa que el microorganismo no se
inhibirá a las concentraciones séricas
habitualmente alcanzadas por la droga cuando esta se administra a
la dosis y por la vía recomendada.

Intermedia: indica que el halo de
inhibición traducido en valores de CMI se aproxima a las
concentraciones de antimicrobiano alcanzables en sangre o tejidos
y que puede esperarse eficacia clínica en aquellas
localizaciones en las que se alcanzan altas concentraciones de
antimicrobiano (ejemplo orina) o cuando se emplean dosis
más elevadas de lo habitual. El CLSI también
incluye en esta categoría aquellos casos de
antimicrobianos con márgenes de toxicidad estrechos en los
que pequeños errores técnicos podrían
suponer cambios de interpretación en la categoría
clínica.

Resultados del método de difusión en agar
mediante discos de oxacilina 1 µg y cefoxitina de 30
µg se interpretará como positivo todo resultado que
indique resistencia de la cepa al disco de oxacilina – cefoxitina
y como negativo el resultado que indique sensibilidad a ambos
discos.

Pruebas de susceptibilidad por difusión en
disco

Las pruebas de sensibilidad in vitro para
bacterias aerobias sin requerimientos especiales pueden ser
determinadas por difusión con disco sobre agar, pudiendo
obtener resultados razonablemente confiables, siempre y cuando
todos los detalles de los procedimientos sean cuidadosamente
estandarizados y controlados.

Principio

Se inocula una placa de agar con el microorganismo
problema, a la que se le depositan discos de papel filtro seco,
que contienen los agentes antimicrobianos. El disco impregnado de
antibiótico hace contacto con la superficie húmeda
del agar, absorben agua del medio, la droga se disuelve y difunde
hacia el medio adyacente siguiendo las leyes físicas que
gobiernan la difusión de las moléculas. El
resultado es un gradiente de concentración de la droga
alrededor del disco. Las células bacterianas que no son
inhibidas por el agente antibacteriano, serán capaces de
crecer en toda la zona alrededor del disco, mientras que en las
bacterias sensibles a la droga, no se observará
crecimiento en el área donde las concentraciones
inhibitorias de la droga estén presentes, o sea, a medida
que aumenta la distancia con respecto al disco, ocurre una
reducción logarítmica de la concentración
del antibiótico hasta que se alcanza un punto en el que el
desarrollo bacteriano de la superficie del agar ya no es
inhibido. El resultado es una zona de inhibición del
desarrollo con bordes bien delineados (halo de
inhibición).

La zona de inhibición es afectada por la
velocidad de difusión de las diferentes drogas a
través del agar, por lo que las zonas observadas con una
droga no pueden ser comparadas con las de otra droga. Sin
embargo, el diámetro de la zona de inhibición es
inversamente proporcional a la CIM.

El método de difusión

Es un método cualitativo recomendado
internacionalmente y se usa para ello el agar Mueller-Hinton, el
más conocido es el método de Kirby-Bauer y
realizado según los procedimientos descritos en el
document M100 S22. Wayne, Pa. 2012 del Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI) , con la utilización de los
discos Unipath-Oxoid, UK (53). Es el que se describe con detalles
por ser el utilizado en esta investigación.

Para esta técnica se recomiendan varios
parámetros, uno de mucha importancia es el relacionado con
el disco de difusión, el cual necesita una carga del
antibiótico propia para esta técnica, el cual debe
manipularse con cuidado, mantenerse en frío y comprobarse
periódicamente su carga valiéndose de cepas de
control existentes, las que presentan halos de inhibición
propios para cada antimicrobiano.

• Medio de cultivo utilizado

El agar seleccionado para realizar antibiograma es el
Mueller-Hinton (anexo 3). Es el óptimo para la
mayoría de las bacterias pues en él pueden crecer
muchos de los gérmenes aislados de material
clínico, poseen bajo contenido de inhibidores, un elevado
índice de reproducibilidad y es de color semitransparente,
por lo que permite observar los resultados y realizar las
mediciones de los halos con facilidad. El volumen del medio por
placa es de 25ml para las placas de 100 por 13mm y de 60ml para
las de 150ml, con una profundidad del mismo de 4 a 6mm

• Preparación del
  inóculo

Partiendo de un cultivo puro se debe tomar de 4 a 6
colonias de apariencia similar con asa o aguja de inocular; se
transfieren a un caldo (2 a 5ml de caldo de tristona soya, caldo
de corazón o caldo Mueller Hinton); se incuban de 2 a 5
horas de 35 a 37º C (fase exponencial del crecimiento). Se
debe controlar la turbidez con patrón Mc Farland, escala
0.5 y ajustar la misma con solución salina
fisiológica o caldo Mueller Hinton.

• Inoculación de las placas

Inocular la superficie de una placa de agar con el
hisopo seco y estéril, se lleva a la suspensión
bacteriana, se elimina el exceso presionando y rotando el hisopo
sobre las paredes del tubo por encima del nivel del
líquido. Se estría la superficie del medio en tres
direcciones haciendo un ángulo de 60º entre una y
otra estría para obtener una siembra uniforme. Por
último, pasar el hisopo por el reborde de la placa de
agar. La estandarización del inóculo se hace porque
el tamaño del halo de inhibición varía
inversamente al tamaño del inóculo. Se deja secar
por 3 a 5 minutos.

• Colocación de los discos

Los discos se colocan manualmente sobre la superficie
del agar utilizando pinzas estériles o con un dispensador
de discos, a una distancia no menor de 15mm del borde de la placa
y una separación entre ellos no menor de 25mm para evitar
la superposición de los halos de inhibición. Dejar
las placas 15 minutos a temperatura ambiente para que comiencen a
difundir los antibióticos. Incubar la placa en
posición invertida a 37º C durante 18 a 24
horas.

• Lectura e interpretación

La zona de inhibición es el área que rodea
al disco donde el crecimiento ha sido completamente inhibido.
Debe ser cuidadosamente medida con una regla e incluye el
diámetro del disco. Los resultados se comparan con los
diámetros de las zonas dadas en la tabla de
interpretación de los halos de inhibición y
permiten expresar en términos de resistente, intermedio y
sensible al microorganismo sometido a la prueba frente a
diferentes drogas.

Hay varios factores que afectan al halo de
inhibición: la carga del antibiótico en los discos,
la difusión del antibiótico en el medio de cultivo,
el tamaño del inóculo bacteriano, la
composición y grosor del medio de cultivo, la velocidad
del crecimiento bacteriano y el tiempo de
incubación.

Los discos de antibióticos son adquiridos
comercialmente. Deben contener la cantidad establecida de
antibiótico y ser conservados a 4º C protegidos de la
humedad.

Anexo 6

Mapa SARM América
Latina

Anexo 7

Mapa SARM del Mundo

A mis padres

A mi esposo

A mis familiares y amigos

A todas las personas que
contribuyeron a la realización de esta
obra.

Autor:

Dra. Anabel Armas
Fernández

Especialista de 1er Grado en Medicina
General Integral

Especialista de 1er Grado en
Microbiología

Dra. Nidia Crespo Toledo

Especialista de 2do Grado en
Microbiología

Máster en Enfermedades
Infecciosas

Dra Egly Expósito
Seguí

Especialista de 1er Grado en medicina
Genera Integral

Especialista de 1er Grado en
Microbiología

Tesis para optar por el Título
de Especialista de 1er Grado en
Microbiología

Universidad de las Ciencias
Médicas

Dr. "Faustino Pérez
Hernández"

Hospital Universitario "Camilo
Cienfuegos"

Sancti Spíritus

2012

"Año 54 de la
Revolución"