Estabilidad oxidativa de huevos enriquecidos con ácidos grasos poliinsaturados omega 3

Fueron alimentadas 192 gallinas ponedoras de 22 semanas
de edad, de linaje comercial Babcock, durante 30 días con
dietas de 0 (cero) y 12,7% de semilla de linaza molida que
corresponde a 0 y 5% de aceite de linaza, respectivamente. Fueron
definidos 8 tratamientos:

grupos con 12,7% de semilla de linaza (control/sin
antioxidante; BHA+BHT, 100+100 ppm; orégano, 200 ppm;
romero, 200 ppm) y 4 grupos sin semilla de linaza, pero
utilizando los mismos antioxidantes. Este estudio fue realizado
con el objetivo de verificar la eficacia del uso de antioxidantes
naturales provenientes del orégano y del romero en la
protección contra el deterioro oxidativo de la
fracción lipídica de las yemas de los huevos
enriquecidos con ácidos grasos poliinsaturados omega 3
(PUFA ?-3). El grado de oxidación lipídica fue
determinado a través de la prueba TBARS

(substancias reactivas con ácido
tiobarbitúrico). Según los resultados obtenidos,
fue verificada diferencia significativa en la reducción
del grado de oxidación lipídica de las yemas de
huevo en todos los tratamientos con antioxidantes, cuando se
compara con el control. Por lo tanto, los extratos de los
condimentos, romero y orégano, pueden ser utilizados
satisfactoriamente para obtener huevos enriquecidos con PUFA ?-3,
mejorando la estabilidad lipídica.

Unitermos

• Peroxidación
lipídica

• Ácidos grasos

• poliinsaturados omega 3

• Antioxidantes naturales

Introducción

La oxidación lipídica, al ser un
fenómeno espon- táneo e inevitable, implicando
directamente en el valor co- mercial sea de los compuestos
grasos, sea de todos los productos que a partir de ellos son
formulados (Silva et al., 1999), conduce a
cambios que ocurren durante el proceso, distribución y
preparación final de los alimentos. La oxidación de
lípidos inicia también otros cambios en los
alimentos que afectan su cualidad nutricional, seguridad, color,
flavor y textura (Shahidi, Wanasundara, 1992). Este aspecto es de
gran importancia, no solamente bajo el enfoque económico,
a través de pérdidas debido a la disminución
de la vida útil, sino también por la posibilidad de
que los radicales libres formados reaccionen con otros
constituyentes de los alimentos provocando una reducción
en la calidad nutricional de los mismos (Nawar, 1996). Los
ácidos grasos esterificados con el glicerol, formando los
triacilglicéridos, son los principales componen- tes de la
fracción lipídica. Entre los ácidos grasos
están presentes estructuras insaturadas que son más
susceptibles a la oxidación de que las saturadas. Los
ácidos grasos insaturados pueden presentar una
insaturación o más, donde se encuentran los
ácidos grasos poliinsaturados

(PUFA) que presentan menor estabilidad
oxidativa que los ácidos grasos monoinsaturados (Nawar,
1996).

La incorporación de los ácidos grasos de
la serie w3 en huevos puede ser hecha a través del
proveimiento de la ración para aves (Marshall et
al., 1994). Sin embargo, por el número de
insaturación, los PUFA son más propensos al ataque
de radicales libres (Papas, 1999) y al daño oxidativo,
siendo utilizados en la determinación de la eficacia de
antioxidantes naturais (Wanasundara, Shahidi,

1998), con el aumento de estos ácidos en las
dietas de las aves, hay um aumento concomitante en la
susceptibilidad al deterioro oxidativo de los huevos, llevando a
la pérdida de las características tanto de la
calidad como del valor nutritivo, menor aceptación del
consumidor y efectos bi- ológicos adversos (Bernal et
al., 2002; López Bote et al.,
1998).

En la ausencia de antioxidantes apropiados, los PUFA
forman radicales libres y pueden tener un efecto prooxidante
significativo llevando a la pérdida de la vita- mina E y
aumento de los productos de oxidación

(Meydani, 1996). Por consiguiente, es un requisito
necesario tener un consumo mayor de antioxidantes para
acompañar un consumo elevado de ácidos grasos
poliinsaturados y obtener así, la acción
benéfica de los mismos (Wiseman, 1996).

Muchos antioxidantes sintéticos como butilhidro-
xianisol (BHA), butilhidroxitolueno (BHT), galato de propilo (PG)
y terbutilhidroquinona (TBHQ), presentan eficacia en la
reducción de la oxidación lipídica a una
concentración de 200 ppm. Antioxidantes naturales extra-
ídos de plantas pueden ser usados como alternativas de los
antioxidantes sintéticos, debido a su efecto equivalente o
mayor en la inhibición de la oxidación
lipídica (Namiki,

1990). Madsen y Bertelsen (1995) y Cintra y Mancini-
Filho (2001) indican algunos condimentos, como romero y
orégano presentando actividad antioxidante
eficaz.

Material y
métodos

Material

La semilla de linaza (Linun
usitatissimum L.) y los condimentos, orégano
(Origanum vulgare L.) y romero

M. E. B. Gómez, C. X.
Mendonça-Junior, J. Mancini-Filho

(Rosmarinus officinalis L.) fueron
adquiridas en el mercado de la ciudad de São Paulo,
Brasil.

Los antioxidantes sintéticos utilizados fueron el
butilhidroxianisol (BHA) y el butilhidroxitolueno (BHT), de las
marcas Sigma y BDH Chemicals Ltd., respectivamente.

Métodos

Determinación del perfil de
ácidos grasos de la linaza La esterificación
de los ácidos grasos del aceite ex- traído de la
linaza por el método de Soxhlet, utilizándose como
solvente éter etílico, fue realizada según
la técnica propuesta por Hartman y Lago, 1973. Para esta
determinación fue utilizado cromatógrafo gaseoso
marca Shimadzu, modelo GC17A, con las siguientes condiciones
cromatográficas:

Columna: capilar de sílica fundida,
Carbowax 20M (30 m x 0,25 mm d.i)

Detector: ionización de
llama

Programación de la columna:
temperatura inicial de 80 °C, aumentar hasta 150 °C (10
°C/min). Aumentar la temperatura hasta 230 °C (6
°C/min) y mantener por 30 min. Gas de arrastre: helio, con
flujo de 1 mL/min. Temperatura del inyector: 250
°C.

Temperatura del detector: 250
°C.

Los metil ésteres de los
ácidos grasos fueron iden- tificados por
comparación con los tiempos de retención de
estándares.

Preparación de las
raciones

Fueron preparadas 2 raciones isocalóricas e
isoproteicas de acuerdo a las tablas NRC (National Research
Council, 1994), conteniendo 0 (cero) y 12,7% de semilla de linaza
molida, que corresponde a 0 y 5% de aceite de linaza,
respectivamente, suplementadas a la di- eta base de maíz y
soya (Tabla I).

A partir de cada una de las raciones, fueron prepa-
radas tres formulaciones conteniendo una mezcla de antioxidantes
sintéticos: BHA 100 ppm + BHT 100 ppm, orégano 200
ppm y romero 200 ppm, separadamente, resultando en seis
tratamientos, cada grupo con su respectivo control (sin
antioxidante), así:

• Control 0% aceite de linaza (0%
linaza molida)

• 0% linaza + BHA / BHT (1)

• 0% linaza + orégano
(2)

• 0% linaza + romero (3)

• Control 5% aceite de linaza (12,6%
linaza molida)

• 5% linaza + BHA / BHT (4)

• 5% linaza + orégano
(5)

• 5% linaza + romero (6)

TABLA I – Formulaciones de las
raciones (%)

(*) Premix vitamínico, mineral y de
aminoácidos provee (por kg de dieta): vitamina A, 7950 UI;
vitamina D3, 2559 UI; vitamina E, 10,5 mg; vitamina K3, 2,6 mg;
riboflavina, 5 mg; vitamina B12, 12 mcg; ácido
nicotínico, 25 mg; ácido pantoténico, 8 mg;
hierro, 50 mg; cobre, 10 mg; zinc, 50 mg; manganeso, 80 mg; yodo,
1 mg; cobalto, 1 mg; selenio,

0,15 mg; metionina, 0,9 g; colina, 0,1 g;
antioxidante, 30 mg.

Experimento

Fueron utilizadas 192 gallinas ponedoras de linage
comercial Babcock de 22 semanas de edad, las cuales fueron
divididas en 8 grupos, (n = 24). Las aves fueron mantenidas en
jaulas individuales y alimentadas ad libitum, durante 30
días.

Muestreo

El muestreo de los huevos fue realizado
durante los 30 días del experimento, dividido
en 4 períodos (0, 10, 20 e 30 días). Fueron
recogidos 12 huevos por tratamiento, las yemas de huevo fueron
liofilizadas y almacenadas en freezer a –18 oC hasta la
ejecución de los análisis.

Determinación del perfil de
ácidos grasos de las yemas liofilizadas

El perfil de ácidos grasos fue determinado por
cromatografía gaseosa, utilizándose el
método de metilación directa de acuerdo a Wang
et al. (2000), siguiendo el siguiente esquema: pesar
aproximadamente

50 mg de yema de huevo en tubo de
esterificación. Añadir el estándar interno
(ácido nonadecanoico C19:0)

2,0 mg/mL de hexano. Colocar 1 mL de metanol y 3 mL de
HCl metanólico 3N. Cerrar y ajustar el tubo y llevar a
baño maría a 95 °C por 1 hora. Enfriar a
temperatura am- biente y aumentar 8 mL de una solución de
NaCl 0,88% y

3 mL de hexano y mezclar en agitador de tubos. Dejar en
reposo hasta separación de las fases. Recoger la fase su-
perior y almacenar en frasco ambar. La muestra está lista
para ser inyectada en el cromatógrafo gaseoso, marca
Shimadzu, modelo GC17A, con las siguientes condicio- nes
cromatográficas:

Columna: capilar de sílica fundida,
Carbowax 20M (30 m x 0,25 mm d.i)

Detector: ionización de
llama

Programación de la columna: temperatura inicial
de 70 °C, mantener por 3 min; aumentar hasta 180 °C (30
°C/min), mantener por 10 min. Aumentar la temperatura
hasta

230 °C (5 °C/min), mantener por 15
min.

Gas de arrastre: helio, con flujo de 3
mL/min. Temperatura del inyector: 230 °C. Temperatura del
detector: 240 °C.

Los metil ésteres de los
ácidos grasos fueron iden- tificados por
comparación con los tiempos de retención de los
estándares. El contenido de los ácidos grasos,
expresado en mg de ácido graso/g de yema, fue calculado de
acuerdo a la siguiente fórmula:

Determinación del grado de
oxidación de las yemas de huevo

Para evaluar la extensión de la oxidación
de los lipídos en las muestras de yemas de huevo, fue
realizada la prueba de TBARS (substancias reactivas con el
ácido tiobarbitúrico), según Vynckel (1970)
y Ramanathan y Das (1992), con algunas adaptaciones de acuerdo al
tipo de muestra:

Pesar 5 g de muestra (yema liofilizada).
Disolver con aproximadamente 17 mL de ácido tricloro
acético

(TCA) al 7,5%. Agitar por 10 min, filtrar y llevar el
filtra- do a un balón volumétrico de 10 mL para
completar el volumen con TCA 7,5%. Colocar 5 mL del filtrado en
un tubo de ensayo con tapa (por duplicado). Añadir 5 mL de
ácido tiobarbitúrico (TBA) 0,02 M en cada tubo.
Agitar y llevar a baño maría hirviente por 40 min.
Enfriar los tubos y hacer la lectura a una longitud de onda de
530 nm. Fue realizada una curva estándar con tetraetoxi
propano (TEP) a una concentración de 6 x 10-5
M/mL.

Tiempo de almacenamiento de las yemas
de huevo

Las yemas liofilizadas de los huevos correspon- dientes
al tiempo final del experimento (30 días de
alimentación de las aves) fueron almacenadas a tempera-
tura ambiente (20-25 °C) por 40 días, divididos en 4
perí- odos: 0, 10, 20 y 40 días, en los cuales fue
realizada la determinación de TBARS.

Análisis
estadística

Los resultados de los análisis
fueron presentados como media y desvío estándar.
Los análisis de varianza

(ANOVA) y la comparación de medias a
través de las pruebas de Dunnett, fueron realizados
utilizando el pro- grama GraphPad Instat, versión
2.01.

Resultados y
discusión

Perfil de ácidos grasos de la
semilla de linaza

En la Tabla II, están presentados los porcentajes
de los diferentes ácidos grasos de la semilla de linaza,
pudiéndose constatar la alta cantidad de ácido
?-linolénico en la semilla oleaginosa.

En la Tabla III se observa el perfil de
ácidos grasos en la fracción lipídica de las
yemas de huevo de las gallinas alimentadas com 0 y 12,7% de
semilla de linaza molida durante 30 días,
pudiéndose verificar la incorpo- ración
significativa de los ácidos grasos poliinsaturados omega
3.

M. E. B. Gómez, C. X.
Mendonça-Junior, J. Mancini-Filho

TABLA II – Perfil de ácidos
grasos de la linaza

Determinación del grado de
oxidación en las yemas de huevo

Se sabe que los ácidos grasos poliinsaturados,
por el hecho de poseer varios dobles enlaces, son susceptibles a
oxidación, por lo tanto, las yemas de huevo enriquecidas
con los mismos, se vuelven también susceptibles al dete-
rioro lipídico, siendo necesario la protección
mediante el uso de antioxidantes. El grado de oxidación de
las yemas y la eficacia del uso de estos antioxidantes fueron
eva- luados a través de la prueba de TBARS, cuyos
resultados fueron expresados en mg de malonaldehído,
MDA/kg de yema liofilizada, siendo esta determinación la
más usada en trabajos científicos en los cuales se
evalúa el grado de peroxidación de la
fracción lipídica, tanto de alimentos como de
tejidos animales (Nam, Ahn, 2003; Lee, Dabrowski, 2003; Lee
et al., 2003; Franchini et al., 2002;
Skrivanova et al., 2001; Yang, Chen, 2001).

Los resultados de esta prueba (Tabla IV), para el
tratamiento con 0% de aceite de linaza, revelaron
disminución de los valores de MDA tanto en los
antioxidantes sintéticos como en los naturales, en los
tiempos 10, 20 y 30 días con relación a su
respectivo control, siendo esta diferencia significativa. Para el
tratamiento con 5% de aceite de linaza, se verificó
diferen- cia significativa (p<0,001) en la reducción de
los valores de MDA en los tiempos 20 y 30 días, para los 3
antioxidantes, como también para el BHA+BHT en el tiempo
10 días. Es necesario destacar que en los grupos control
huvo aumento en el valor de la absorbancia en el transcurso del
tiempo, sin embargo, en los tratamientos con antioxidantes esta
característica fue inversa. Se observó
también que en el tiempo 0 (cero) en las 2
dietas

(0 y 12,7% de semilla de linaza) para todos los
antioxidantes, los valores de MDA fueron más altos que el
control.

TABLA III – Perfil de ácidos
grasos en yemas liofilizadas de huevos enriquecidos con
ácidos grasos omega 3

Es importante destacar que los valores de MDA de todos
los tratamientos de la dieta con 12,7% de semilla de linaza en
los diferentes tiempos, fueron mayores cuando comparados con los
tratamientos con 0% de linaza. Estos resultados sugieren que el
mayor número de insaturación del
ácido

presente
en la linaza, provocó un mayor grado de
oxidación.

En general, en las 2 dietas (0 y 12,7% de semilla de
linaza), en los 3 períodos de tiempo la presencia de los
antioxidantes naturales y sintéticos mostró
protección

TABLA IV – Prueba de TBARS en las
yemas liofilizadas de huevo de los tratamientos con 0 y 12,7% de
semilla de linaza con su respectivo control, sin antioxidante, en
los 4 períodos de tiempo, expresados en mg de MDA/kg yema
liofilizada

Tiempo expreso en días; ns media no difiere
estadísticamente del control 0 (cero) día
(p>0,05); * media difiere estadísticamente del control
0 día a un nivel de error de 5% (p<0,05); ** media
difiere estadísticamente del control 0 día a un
nivel de error de 1% (p<0,01); *** media difiere
estadísticamente del control 0 día a un nivel de
error de 0,1%

(p<0,001) considerable contra la
oxidación lipídica, comprobándose
así, su efecto antioxidante en el modelo experimental uti-
lizado en este trabajo.

En el estudio realizado por Aymond y Van
Elswyk (1995), fueron determinados los valores de las substancias
reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS)
expresados em mg de TBARS/kg de yema. Fueron probados huevos en-
riquecidos con PUFA ?-3 a través de dietas suple- mentadas
con 5 y 15% de semilla de linaza entera e molida durante 5
semanas. Em este ensayo no fue encontrada di- ferencia
significativa entre los valores de TBARS de los tratamientos
(0,20-0,23 mg/kg de yema) en relación al control (0,18
mg/kg de yema). Con todo, en nuestro trabajo encontramos
diferencias estadísticamente signifi- cativas entre los
tratamientos con 0 y 5% de aceite de linaza, revelando por lo
tanto, que la peroxidación lipídica ocurrió
por la presencia de la mayor cantidad de ácidos grasos
poliinsaturados.

Para Qi y Sim (1998) el uso de tocoferol
natural (0, 200, 400 y 800 mg/kg de dieta) en dietas
suplementadas con 15% de linaza y 0,5% de aceite de pescado,
llevó a la reducción significativa de los valores
de TBARS de 41,32 a 18,57 nmol de malonaldehído/g de yema.
Esta protección contra la oxidación, por parte del
antioxidante, observada por los mencionados autores, apoyan
nuestros resultados, los cuales sugieren que la estabilidad
lipídica de los huevos enriquecidos con PUFA ?-3 puede ser
mejorada por la incorporación de antioxidantes, tanto sin-
téticos como naturales.

A través de los valores de MDA presentados en la
Tabla V, puede ser verificado una vez más la
actuación de los antioxidantes naturales en la
protección contra la oxidación lipídica en
las yemas de huevo sometidas a almacenamiento por un
período de 40 días. Según estos valores se
puede deducir que el grado de oxidación lipídica
está en función del tiempo, así, de forma
general, huvo aumento de los valores de MDA en el transcurso del
tiempo, cuando comparados con el tiempo 0 (cero) día,
ocurriendo mayor oxidación en el tiempo final (40
días). Podemos observar también la actuación
de los anti- oxidantes tanto sintéticos como naturales en
la protección contra la oxidación lipídica,
presentando diferencias sig- nificativas (p<0,01) cuando
relacionados con su respecti- vo control.

Esta respuesta se constata a partir del tiempo 10
días de alimentación de las aves. Es importante
desta- car los valores más altos de MDA para los
tratamientos con 5% de aceite de linaza cuando comparados con 0%
de aceite, a partir del tiempo 10 días de
alimentación, verificándose así la mayor
susceptibilidad de los ácidos grasos poliinsaturados al
deterioro lipídico.

Los efectos benéficos para la salud, ofrecidos
por los PUFA ?-3 incorporados en las yemas de huevo, pueden estar
limitados por la calidad oxidativa. Marshall et
al.

(1994) determinaron la estabilidad de huevos con
cáscara, de gallinas alimentadas con 1,5% de aceite de
menhaden, almacenados a temperatura de refrigeración
durante 4 se- manas. Los autores indicaron que, aunque los
valores de TBARS en las yemas no hubiesen aumentado durante el
almacenamiento de los huevos con cáscara, los TBARS fueron
mayores en la yema de los huevos con aceite de menhaden quando
comparados con el control. Estos resul- tados no están en
conformidad con os encontrados en nuestro trabajo, en el cual se
verificó aumento de la oxidación en el transcurso
del tiempo de almacenamiento de las yemas de huevo a temperatura
ambiente (20-25 °C). Sin embargo, fue observada diferencia
significativa en el efecto de la dieta, como fue encontrado por
Marshall et al.

(1994), que sugieren que la presencia de
TBARS puede ser debido al consumo y consiguiente
incorporación de productos de la oxidación
lipídica por parte de las aves o la producción
in vivo de TBARS en los hígados de las aves
alimentadas con dietas altamente insaturadas, para después
ser transportados y depositados en las yemas de los huevos.
Aymond y Van Elswyk (1995) mencionan que la protección
lipídica parcial dada por la cubierta de la semilla de
linaza intacta podría reducir el potencial para la
producción de huevos conteniendo lípidos oxidados,
por lo tanto, el uso de la semilla entera en las dietas de las
aves resultaria en huevos enriquecidos con

con valores de TBARS reducidos cuando son comparados con la
semilla molida y/o aceite de pescado. Sin embargo, la
utilización de linaza molida en las dietas de las aves,
favorece en la digestión y absorción del
aceite.

TABLA V – Prueba de TBARS en las
yemas liofilizadas almacenadas durante 40 días a 20-25 oC,
correspondientes al tiempo final del experimento, expresados en
mg de MDA/kg de yema liofilizada

Se sabe que los productos de la oxidación
lipídica, como aldehídos, cetonas,
hidroxiácidos, entre otros, pueden ocasionar daño
de tejidos biológicos, por lo tanto, cabe indicar que es
necesario considerar la estabilidad oxidativa de los productos
enriquecidos con PUFA, entre ellos, los huevos ?-3, estabilidad
que puede ser alcanzada a través de la utilización
de antioxidantes tanto sintéticos como
naturales.

Conclusión

Mediante el uso de la semilla de linaza en la
ración de gallinas ponedoras se obtuvieron huevos con alta
concentración de ácidos grasos poliinsaturados y
por lo tanto susceptibles de oxidación. La actividad
antioxidante de los extractos de los condimentos romero y
orégano aumentó la estabilidad de los huevos
enriquecidos con PUFA ?-3.

Resumo

Estabilidade oxidativa de ovos
enriquecidos com ácidos graxos poliinsaturados ômega
3, frente a antioxidantes naturais

Foram alimentadas 192 galinhas poedeiras de 22 sema- nas
de idade da linhagem comercial Babcock, durante 30 dias com
dietas constituídas de 0 (zero) e 12,7% de semen- te de
linhaça moída correspondente a 0 e 5% de
óleo de linhaça, respectivamente. Foram definidos 8
tratamentos:

4 grupos com 5% de óleo de linhaça
(controle/sem antioxidante; BHA+BHT, 100+100 ppm; orégano,
200 ppm; alecrim, 200 ppm) e 4 grupos sem óleo de
linhaça, mas utilizando os mesmos antioxidantes. Este
estudo foi realizado com o objetivo de verificar a
eficácia do uso de antioxidantes naturais provenientes do
orégano e do alecrim, na
proteção contra a deterioração
oxidativa da fra- ção lipídica das gemas dos
ovos enriquecidos com ácidos graxos poliinsaturados
ômega 3 (PUFA ?-3). O grau de oxidação
lipídica foi determinado através do teste
TBARS

(substâncias reativas com ácido
tiobarbitúrico). De acor- do aos resultados obtidos,
verificou-se diferença signifi- cativa na
redução do grau de oxidação
lipídica das gemas de ovo em todos os tratamentos com
antioxidantes, quan- do relacionados ao seu respectivo controle.
Portanto, os extratos das especiarias, alecrim e orégano,
podem ser utilizados satisfatoriamente para se obter ovos
enriqueci- dos com PUFA ?-3, melhorando a estabilidade
lipídica.

UNITERMOS: Peroxidação
lipídica. Ácidos graxos poliinsaturados ômega
3. Antioxidantes naturais.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a FAPESP y al CNPq por el apoyo financiero y
a CAPES por la beca de investigación en el programa
PEC-PG.

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Recebido para publicação em
07 de abril de 2003.

Autor:

María Elena Bernal
Gómez1,

Cássio Xavier de
Mendonça-Junior2,

Jorge Mancini-Filho1*

*Correspondencia: J.
Mancini-Filho

Departamento de Alimentos e

Nutrição

FCF, USP

Av. Lineu Prestes 580, Bloco 14, Cidade
Universitária

05508-900, São Paulo-SP,
Brasil

1Departamento de Alimentos e
Nutrição Experimental, Faculdade de Ciências
Farmacêuticas, Universidade de São Paulo,
2Departamento de Clínica Médica, Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de
São Paulo

Enviado por:

Andres Flores Vela

Revista Brasileira de Ciências
Farmacêuticas Brazilian Journal of Pharmaceutical
Sciences vol. 39, n. 4, out./dez., 2003