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Síntesis y Caracterización de AuNPs para su Funcionalización con Sondas Específicas de DNA



  1. Introducción y
    antecedentes
  2. Resultados
  3. Conclusiones
  4. Referencias

Introducción y
antecedentes

Las nanopartículas (NPs) de metales nobles, y
específicamente, las nanopartículas de oro (AuNPs),
exhiben excelentes propiedades físicas, químicas y
biológicas, que son intrínsecas a su tamaño
(Saifuddin et al., 2009).

Un aspecto de relevancia es la coincidencia de escala de
tamaño, el nanómetro (1 X 10-9metros), con las
unidades básicas de la vida encerradas dentro de la
membrana celular o de su núcleo. Los cromosomas, un virus
o una molécula tienen tamaño nanométrico;
esta convergencia de escala ha conducido el aterrizaje de la
nanotecnología en la Biofísica (Hernando 2007),
figura 1.

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Figura 1.
Algunas unidades Básicas de la vida de tamaño
manométrico. Imagen modificada de google
imagens

Las AuNPs pueden ser producidas con distintos
tamaños y formas y ser fácilmente funcionalizadas
con un amplio abanico de ligandos, tales como: anticuerpos,
polímeros, sondas de diagnóstico, fármacos,
material genético, inclusive para la detección de
amenazas químicas y biológicas (Upadhyayula, 2012).
Por todo ello, las AuNP han despertado un gran interés en
diversos campos del conocimiento científico, especialmente
en los estudios de las áreas biomédica y ambiental
(Castro-Ortíz, 2007; Wei et al., 2010;
Díaz et al., 2011).

Por otro lado los microorganismos se constituyen como
buenos indicadores del estado trófico de los ecosistemas y
responden a los disturbios ocurridos modificando su estructura en
cuanto a composición y abundancia se refiere. La
detección de cambios en los ecosistemas acuáticos,
específicamente a partir de las comunidades de hongos,
bacterias y algas, en la actualidad es ampliamente utilizada y
constituye un mecanismo confiable y de bajo costo, debido a que
no requiere de equipos muy sofisticados para evaluar las
alteraciones en los sistemas, puesto que dichos microorganismos
reflejan los cambios que se han presentado en un recurso
hídrico, a diferencia de los parámetros
fisicoquímicos que solo muestran las situaciones puntuales
del momento de la muestra.

En este trabajo se realiza la síntesis
(química y biológica) caracterización de
AuNPs y funcionalización con sondas específicas de
DNA de dos microorganismos de interés ambiental Achlya
sp.
y Escherichia coli (E.coli).
Achlya sp.es un hongo que infecta peces en
piscifactorías, acuarios y embalses naturales; E
coli
, es una bacteria patógena para los humanos y
puede ser fuente de contaminación en alimentos y
agua.

Las AuNPs funcionalizadas con DNA podrán ser
utilizadas en el diseño y construcción de
biosensores ambientales para detectar los microorganismos antes
mencionados, permitiendo monitorear, prevenir y corregir aspectos
que causen desequilibrios ecológicos en ambientes
acuáticos tales como los canales de Xochimilco,
hábitat del pez endémico Girardinichtys
viviparus
, que se encuentra en peligro de extinción
(Navarrete-Salgado et al., 2004), debido a la
sobreexplotación, contaminación con descargas de
aguas residuales y la consecuente infección de Achlya
sp
.

Estos nuevos dispositivos analíticos
(genosensores) proporcionan información de forma
rápida, simple y de bajo costo, comparada con las
técnicas convencionales.

Acerca de la síntesis biológica de
nanopartículas utilizando extractos de plantas, Narayanan
y Sakthivel, 2011 mencionan que es más sostenible y
renovable que la síntesis química, además de
que el uso de plantas y sus productos es más ventajoso que
el uso de microorganismos ya que éstos necesitan
metodologías costosas para el mantenimiento del cultivo
microbiano y del proceso de síntesis.

La funcionalización de las AuNPs mediante el
sistema Estreptavidina- Biotina ha sido usada durante muchos
años en múltiples aplicaciones. Diamandis y
Christopoulos (1991), lo utilizan en ensayos de reacción
inmunológica y de hibridación de ácidos
nucleídos.

Wang et al., 2001 reportan la detección
electroquímica del gen BRCA1 asociado a cáncer de
mama y ovario. Este fue el primer reporte de detección
electroqímica de DNA con nanopartículas de oro
funcionalizadas con estreptavidina.

En cuanto al diseño de sondas específicas
de DNA (oligonucleótidos) para los microorganismos
Achlya sp. y E. coli, no se encontró
ningún trabajo en la literatura que lo reporte, sobre todo
en lo que se refiere a Achlya sp. Mendoza (2011)
construyó un biosensor basado en nanoestructuras, mediante
el uso de DNA como molécula de biorreconocimiento
(genosensor), utilizando AuNPs como marca, para la
detección electroquímica de E. coli,
mediante el evento de hibridación, sin embargo las
secuencias genéticas utilizadas fueron tomadas de la
literatura.

Alvarado (2012) construyó un biosensor
electroquímico de afinidad usando un anticuerpo como
molécula de reconocimiento (inmunosensor), basado en AuNPs
como marca y utilizando partículas
superparamagnéticas como plataforma para la
inmovilización del anticuerpo (anti- E. coli),
todo ello sobre un electrodo de grafito-epoxi compósito
con un imán integrado (M-GECE) que actuó como
electrodo de trabajo, para la detección de E.
coli
en agua.

Resultados

Síntesis Química

Las AuNPs fueron sintetizadas por el método de
Turkevich et al. (1951), con algunas modificaciones,
este método es sencillo y relativamente rápido. En
la figura 2 se observan las AuNPs sintetizadas y el
espectro Uv-Vis.

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Figura 2.
Espectro Uv-Vis de AuNPs sintetiadas
químicamente

Con esta caracterización se observó una
longitud de onda máxima de absorción de las AuNPs
sintetizadas de 519.5 nm, lo cual indica que se cuenta con AuNPs
de aproximadamente 20 nm, ya que en la literatura se reporta un
espectro de 520 nm para las mismas (Carralero, 2009).

Síntesis Biológica

La síntesis biológica de AuNPs se
realizó con una combinación de las técnicas
de Turkevich et al., 1951 y Rico-Moctezuma et al 2010.
Se utilizó extracto de Opuntia sp. (nopal),
Allum sp. (cebolla), Pyrus sp. (pera),
Coffea sp. (café) y Laurus sp. (laurel),
como agente reductor; en la tabla 1 se observan los
extractos obtenidos, el pH y la longitud de onda de las AuNPs
sintetizadas, en la figura 3 se observan los espectros de
UvVis.

Tabla 1. Extractos de
las diferentes plantas utilizados como agente reductor en la
síntesis biológica de AuNPs.

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Figura 3. Espectro UV-Vis de las AuNPs
biosintetizadas

Diseño de Sondas

El diseño de las sondas se realizó
utilizando el programa Primer Blast. En la tabla 2 se
observa el resultado.

Tabla 2. Sondas
Diseñadas

Microorganismo

NCBI/ GeneBank

Sonda
Diseñada

Achlya sp.

JQ974991.1

5" GCACCGGAAGTACAGACCAA
3"

E. coli O157:H7

NZ_AERR00000000.1

5" TTGCTTTGGCAAGTCCTCCT
3"

Estas sondas ya han llegado al laboratorio de
Microbiología Ambiental y estamos por realizar la
funcionalización de las AuNPs.

Conclusiones

  • La síntesis química y
    caracterización por UV-Vis, TEM y AFM de las AuNPs
    muestra que se obtuvieron AuNPs de aproximadamente 20nm, de
    forma esférica y monodispersas las cuales pueden ser
    funcionalizadas con DNA.

  • Con la biosíntesis de AuNPs a partir de
    extractos de plantas se obtuvieron nanopartículas de
    diferentes tamaños y formas.

  • La siguiente fase del proyecto consistirá en
    la funcionalización de las sondas de DNA con las AuNPs
    sintetizadas tanto químicamente como
    biológicamente. Estas técnicas se
    llevarán a cabo en el Laboratorio de
    Microbiología Ambiental de la UAM-A.

Referencias

Alvarado, Vanegas Susana. (2012) «Biosensor
Electroquímico de Afinidad para la Deteccion de E. Coli en
agua.» Proyecto Terminal de la carrera en Ingeniería
Química, UAM-Azcapotzalco, Mexico D.F.

Castro-Ortíz, P.B., Luna Pabello, V.M y
Villalobos Pietrini R. (2007) «Estado del Arte y
Perspectivas del uso de biosensores ambientaes en
MéxicoRevista Internacional de
Contaminación Ambiental
23:35-45

Díaz, J., B. Fontal, D. Combita, C.
Martínez, y A. Corma. (2011) «Sintesis de nano-Au
soportados en oxidos metalicos y su sactividad catalitica en
reacciones de oxido redución de CO.» Rev.
LatinAm. Metal. Mat.
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Bolívar.) 33: 43-53.

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Rev.R.Acad.Cienc.Exact.Fís.Nat. 101:
321-27.

Mendoza, Gutiérrez G. (2011)
«Detección electroquímica de E.coli,
mediante un biosensor basado en nanoestructuras.»
UAM-Azcapotzalco, Mexico, D.F.

Navarrete Salgado, N., Contreras Rivero, G.,
Elías Fernándz, G. y Rojas Bustamante M.L.
(2004)«Situacion de Giriardinichthys viviparus, especie que
se encuentra en peligro de extinción.» Revista
de Zoología
(Universidad Nacional Autónoma de
México (UNAM) 15: 1-6.

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Sanchez-Mendieta, Avalos-Borja M., y M.A.
Camacho-López.(2010) «Biosíntesis de
nanoparticulas de oro mediante el extracto de Opuntia ficus
indica.» Supericies y Vacio, 23: 94-97.

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Upadhyayula, Venkata K.K. (2012) «Functionalized
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Wang, J. (2003) Nanoparticle-based electrochemical DNA
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Wei, Yanhu i, Shuangbing Han, Jiwon Kim, Siowling Soh, y
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Mediated by Dynamic Aggregation of Nanoparticles.» J.
AM. CHEM. SOC.
( American Chemical Society.) 132:
11018-11020.

 

 

Autor:

Blanca Estela Chávez
Sandoval*,

María Teresa Castañeda
Briones,

Francisco García
Franco,

Susana Alvarado Vanegas

Ezel J. Galindo
Pérez.

Universidad Autónoma
Metropolitana-Azcapotzalco

México D.F.

 

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